心脏骤停(cardiac arrest, CA)是当今世界发生率高、存活率低的重大公共卫生问题。最新数据显示,每年美国发生CA事件近36万,出院存活率仅10.6%[1]。我国每年CA发生约50万,出院存活率低达1.3% [2-3]。研究表明,心脏骤停复苏后,机体经历全身缺血再灌注损伤,继发炎症反应、氧化应激及钙超载等多种致伤机制,最终导致复苏后脑损伤与心功能障碍为主的多脏器功能不全[4]。其中,45%~60%患者在心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation, CPR)后出现严重的或致死性的心功能障碍,是CA患者早期死亡的最主要原因[4-5]。如何改善心功能障碍成为复苏后早期阶段治疗的关键。
消退素D1是一种新型脂质介质,研究显示,消退素D1能产生强大的抗炎和促炎症消退作用[6-7]。在局部器官缺血-再灌注损伤模型中,研究发现,消退素D1具有保护包括心、脑、肺、肾在内等多器官作用[8-11]。然而,少有研究报道消退素D1改善心脏骤停复苏后多器官功能障碍的作用。本研究选择与人类生理参数接近的猪作为实验动物,同时结合临床CA事件的治疗时间窗,选择复苏成功后5 min给药,拟探讨不同剂量消退素D1对复苏后心功能障碍的影响及可能机制,为其临床转化提供依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物及分组国产健康雄性白猪28头,体质量(36±3) kg,购自上海甲干生物科技有限公司,动物合格证号SCXK(沪)2015-0005。所有动物标准饲料喂养,自由饮水。采用随机数字表法分为4组(n=7):假手术组(S组)、心肺复苏组(CPR组)、低剂量消退素D1组(LRD组)和高剂量消退素D1组(HRD组)。S组仅进行动物准备,其他三组经历心脏骤停/复苏过程。复苏成功后5 min时,LRD组经股静脉注射消退素D1(购自美国Cayman公司)0.3 μg/kg,HRD组经股静脉注射消退素D10.6 μg/kg,S组和CPR组经股静脉注射等量溶媒。
1.2 实验仪器深圳迈瑞SynoVent E5呼吸机,深圳迈瑞BeneView T6监护仪,上海三埃弗PMSH-300手持式ETCO2/SPO2监测仪,美国ZOLL的E Series除颤监护仪与CPR stat-padz除颤电极,德国PULSION的PiCCOplus容量监测仪及附件,美国EDWARDS的Swan-Ganz导管与压力传感器,电动负压吸引器。
1.3 动物准备实验前,动物禁食12 h,不禁水。实验中,氯胺酮20 mg/kg肌肉注射诱导麻醉后,戊巴比妥钠30 mg/kg经耳缘静脉实施静脉全麻,此后戊巴比妥钠8 mg/(kg·h)维持麻醉状态。静脉全麻后,经口气管插管,连接ETCO2/SPO2监测仪和呼吸机,进行机械通气。呼吸机参数设置为潮气量12 mL/kg、峰流速40 L/min和FiO2 21%。通过调节呼吸机呼吸频率维持呼气末二氧化碳分压(PETCO2)在35~40 mmHg。通过双上肢与左下肢心电电极,进行常规的Ⅱ导联心电图连续监测。
暴露右股动脉,用于CA前、复苏后植入PiCCO动脉导管和采集动脉血标本,及CPR期间植入Swan-Ganz导管监测胸主动脉血压。暴露右股静脉,用于植入Swan-Ganz导管监测右心房压、核心温度和采集静脉血标本。暴露右颈外静脉,用于CA前、复苏后植入PiCCO静脉导管,及CA时植入诱颤电极至右心室。整个实验过程中,使用控温毯维持动物体温在(38.0±0.5)℃。
1.4 电刺激法诱导室颤诱颤前10 min,采集动物的基础数据,如血流动力学参数、心功能指标、动脉血气及静脉血标本等。经诱颤电极释放1 mA交流电至右心室,诱导心室颤动。诱颤成功标准为心电图呈室颤波形,动脉血压显著下降、搏动波形消失。室颤成功后,断开呼吸机,停止机械通气,无干预观察8 min,然后开始CPR,其包括人工胸外按压和球囊辅助通气,比例30: 2。ZOLL除颤监护仪用于实时监测胸外按压质量,保证按压深度≥5~6 cm、频率≥100~120次/min。CPR 2.5 min后,静脉注射肾上腺素20 μg/kg。CPR 5 min后,给予能量150 J的双向波电除颤1次,并判断是否自主循环恢复。自主循环恢复的标准为室上性自主心律伴平均动脉压>50 mmHg,持续5 min以上[12]。若自主循环未恢复,立即进行2 min的CPR,然后电除颤1次。如此重复此流程5次后,动物仍未达到自主循环恢复,视为复苏失败。肾上腺素在首次注射后,每3 min重复使用一次。复苏成功的动物,重新机械通气观察6 h后脱机拔管,并拔除全身各处有创导管,消毒与缝合切口,送回饲养房观察18 h。复苏后24 h时,再次采集数据与血标本,然后静脉注射戊巴比妥钠150 mg/kg予以安乐死,迅速获取组织标本,以及进行动物尸体解剖,记录重要脏器的解剖结果。
1.5 观察指标实验过程中,持续监测所有动物的心率、血压、PETCO2与体温等。CPR期间,记录所有动物的复苏情况,如冠脉灌注压、复苏时间、复苏成功率、肾上腺素用量及除颤次数等。在CA前抽取动脉血,进行血气分析,检测动脉血乳酸水平。在CA前与复苏后3 h、6 h、24 h时,进行PiCCO监测,评估每搏输出量(stroke volume, SV)、全心射血分数(global ejection fraction, GEF)的变化;同时,采集静脉血标本,离心获取血清,应用ELISA法检测血清心肌肌钙蛋白(cardiac troponin I, cTNI)的水平,试剂盒购自上海美轩生物科技有限公司。复苏后24 h时,动物实施安乐死,迅速获取左室心尖部心肌组织,制备组织匀浆液,应用ELISA法检测心肌组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与白细胞介素-6(IL-6) 的含量,试剂盒购自上海美轩生物科技有限公司;以及应用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.6 统计学方法使用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示,进行方差分析和Bonferroni事后检验。计数资料比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组动物的基本情况CA前,各组动物的体质量、血流动力学参数、PETCO2、血乳酸水平、心功能指标及心肌损伤标志物等基础特征,组间比较差异均无统计学意义(P<0.05),见表 1、4。
组别 | 体质量(kg) | PETCO2(mmHg) | 心率(次/min) | MAP(mmHg) | 乳酸(mmol/L) |
S组 | 35±2 | 40±2 | 105±6 | 110±8 | 1.1±0.5 |
CPR组 | 36±3 | 39±2 | 108±10 | 108±12 | 1.3±0.4 |
LRD组 | 35±3 | 40±3 | 103±12 | 113±10 | 1.2±0.3 |
HRD组 | 37±2 | 38±2 | 107±8 | 116±11 | 1.1±0.3 |
注:PETCO2为呼气末二氧化碳分压;MAP为平均动脉压;1 mmHg=0.133 kPa |
组别 | SV(ml) | GEF(%) | cTNI(pg/ml) | |||||||||||
CA前 | PR 3 h | PR 6 h | PR 24 h | CA前 | PR 3 h | PR 6 h | PR 24 h | CA前 | PR 3 h | PR 6 h | PR 24 h | |||
S组 | 48±2 | 47±3 | 48±4 | 48±4 | 32±1 | 31±2 | 30±2 | 31±3 | 154±21 | 183±19 | 190±24 | 185±25 | ||
CPR组 | 49±5 | 23±4a | 27±6a | 29±5a | 31±3 | 14±1a | 16±3a | 20±2a | 161±18 | 324±56a | 611±44a | 553±47a | ||
LRD组 | 50±6 | 28±5ab | 32±3ab | 35±5ab | 31±4 | 17±2ab | 20±2ab | 23±2ab | 164±15 | 247±34ab | 553±37ab | 436±23ab | ||
HRD组 | 50±8 | 31±5ab | 36±6abc | 41±5abc | 30±4 | 19±2ab | 23±3abc | 26±3abc | 168±20 | 230±26ab | 501±34abc | 371±29abc | ||
注:SV为每搏输出量;GEF为全心射血分数;cTNI为心肌肌钙蛋白I;CA为心脏骤停;PR为复苏后;与S组比较,aP<0.05;与CPR组比较,bP<0.05;与LRD组比较,cP<0.05 |
经历心脏骤停/复苏过程的三组动物,在心肺复苏期间获得一致的CPP,组间比较差异无统计学意义(P<0.05),见表 2。复苏效果分析显示,三组动物的复苏成功率、复苏时间、除颤次数、肾上腺素用量等指标比较,组间差异无统计学意义(P<0.05),见表 3。
组别 | CPP(mmHg) | ||||
1 min | 2 min | 3 min | 4 min | 5 min | |
CPR组 | 16±3 | 21±2 | 29±3 | 36±4 | 25±4 |
LRD组 | 17±4 | 22±3 | 28±5 | 38±6 | 26±5 |
HRD组 | 17±2 | 22±3 | 30±4 | 37±6 | 27±7 |
注:CPP为冠脉灌注压;1 mmHg=0.133 kPa |
组别 | ROSC | 复苏时间(min) | 除颤次数 | 肾上腺素用量(mg) |
CPR组 | 6/7 | 6.5±3.0 | 1.7±1.1 | 1.16±0.97 |
LRD组 | 6/7 | 6.1±2.9 | 1.5±1.2 | 1.05±0.91 |
HRD组 | 6/7 | 6.0±3.3 | 1.4±1.3 | 1.03±0.87 |
注:ROSC为自主循环恢复 |
与S组相比,其他三组动物在心肺复苏后均出现心功能障碍,表现为SV与GEF值显著降低,同时心肌损伤标志物cTNI的浓度显著增加,组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。与CPR组相比,在进行消退素D1治疗的两组动物的心功能指标如SV与GEF值明显升高,心肌损伤标志物cTNI的浓度显著减少,组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。与LRD组相比,HRD组动物的心功能指标与心肌损伤标志物水平得到进一步改善,在复苏后6 h、24 h时两组间比较差异有统计学意义(均P<0.05)。见表 4。
2.4 心肺复苏后24 h时各组动物心肌组织炎症与氧化应激相关指标的比较与S组相比,其他三组动物在心肺复苏后均出现心肌炎症反应和氧化应激损伤,表现为心肌组织TNF-α、IL-6与MDA含量明显增加,SOD活性显著下降,组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。与CPR组相比,低剂量与高剂量消退素D1组心肌炎症反应与氧化应激损伤均明显减轻,表现为心肌组织TNF-α、IL-6与MDA含量明显减少,SOD活性显著升高,组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。与LRD组相比,HRD组动物的心肌炎症反应与氧化应激损伤得到进一步减轻,组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表 5。
组别 | TNF-α(pg/ml) | IL-6(pg/ml) | MDA(nmol/mg) | SOD(U/mg) |
S组 | 84±15 | 186±34 | 0.85±0.34 | 5.01±0.23 |
CPR组 | 653±112a | 824±117a | 6.37±1.26a | 0.89±0.31a |
LRD组 | 442±87ab | 563±68ab | 3.95±0.96ab | 2.27±0.93ab |
HRD组 | 218±55abc | 403±61abc | 2.54±1.21abc | 3.36±0.74abc |
注:TNF-α,肿瘤坏死因子-α;IL-6,白介素-6;MDA,丙二醛;SOD,超氧化物歧化酶;与S组比较,aP<0.05;与CPR组比较,bP<0.05;与LRD组比较,cP<0.05 |
消退素D1是近来发现的一种新型脂质介质,其来源于长链多不饱和脂肪酸衍生物家族,属于源自ω-3二十二碳六烯酸的D类消退素[13]。早期研究显示,消退素D1能抑制炎性细胞的局部浸润,降低局部炎症因子的聚集,表现出强大的抗炎促消退作用[6-7]。近来研究发现,消退素D1具有抑制炎症、氧化应激及细胞凋亡等多种保护性作用机制,能有效地减轻多种器官的缺血再灌注损伤。2006年,Duffield等[8]制作小鼠肾缺血再灌注损伤模型,发现消退素D1能降低血清肌酐水平,减少急性肾衰竭的发生。2014年,Luo等[9]在小鼠全脑缺血损伤模型中,发现消退素D1能改善小鼠认知功能障碍,减轻海马CA1区神经元损伤,其机制与NF-κB表达下调、促炎介质生成减少等有关。2015年,Gilbert等[10]研究发现消退素D1能抑制大鼠心肌缺血再灌注后PI3K/Akt信号通路的激活与凋亡标志蛋白caspase-3、caspase-8的表达,结果显著地缩小心肌梗死面积。2016年,Zhao等[11]研究发现消退素D1通过抑制炎症反应、纠正氧化/抗氧化失衡、减少细胞凋亡等途径,进而减轻大鼠肺缺血再灌注损伤程度。
心脏骤停/复苏作为缺血再灌注损伤的一种特殊形式,其导致的心肌缺血再灌注损伤是复苏后心功能障碍的主要原因。本研究通过制作猪心肺复苏模型,试图探讨消退素D1改善复苏后心功能障碍的作用效果。根据文献资料提示0.3 μg/kg与0.9 μg/kg消退素D1均能缩小心肌梗死面积、产生显著的心肌保护作用[10],本项目选择0.3 μg/kg、0.6 μg/kg两个剂量探讨药物作用于器官的剂量效应。数据结果显示,低剂量与高剂量消退素D1均能明显改善动物复苏后3 h、6 h与24 h时的心功能障碍程度,以及显著降低同时间点的心肌损伤标志物水平;另外,高剂量消退素D1组动物的复苏后心功能恢复速度优于低剂量组,且在复苏后6 h、24 h时组间出现显著性差异。这一结果提示,消退素D1能减轻复苏后心肌损伤,改善复苏后心功能障碍,且存在一定的剂量效应关系,但其最佳干预剂量有待进一步探讨。
目前认为,复苏后心功能障碍的病理生理机制,主要考虑与氧自由基产生、钙超载、炎性介质浸润、线粒体功能障碍、能量代谢异常及微血管损伤等多种因素有关[14]。Niemann等[15]研究显示,心脏骤停复苏后机体内促炎介质TNF-α和白介素-1β的含量明显增加,左室功能显著下降,且促炎介质的增加与心功能障碍的程度呈显著相关性。张明月等[16]研究发现,猪心肺复苏后心肌纤维出现肿胀、排列紊乱、断裂与扭曲,大片心肌纤维溶解坏死,心肌间质可见大量炎性细胞浸润。林珮仪等[17]研究表明,心肺复苏后心功能指标如SV明显下降,同时心肌组织MDA含量增加、SOD活性降低,提示复苏后心功能障碍与氧化应激损伤有关。另有研究表明,通过抑制IL-1β、IL-6等促炎介质的表达,以及调节机体氧自由基代谢,均可减轻复苏后心肌损伤,改善心功能障碍[18]。
结合复苏后心功能障碍的大体病理损伤机制,当前研究还选择探讨了消退素D1对复苏后心肌组织炎症反应和氧化应激损伤的影响。研究结果显示,在进行不同剂量的消退素D1治疗干预后,心肌组织水平炎症介质TNF-α与IL-6的含量明显减少,同时氧化应激相关因子MDA的含量亦明显减少、SOD活性显著升高,提示消退素D1能减轻猪心肺复苏后心肌组织炎症反应和氧化应激损伤,进而发挥复苏后心肌保护作用。
综上所述,消退素D1能通过减轻心肌组织炎症反应和氧化应激损伤,有效地改善猪心肺复苏后心功能障碍。上述研究结果,将为复苏后心功能障碍的临床治疗提供一种新的参考方案,为消退素D1在临床的转化应用提供依据。
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