缺血性脑血管疾病是严重威胁人类健康的疾病之一，是病残和死亡的重要原因之一，人们一直在探讨新的治疗方法和治疗药物以挽救患者。目前认为缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, I/R)与氧化应激细胞内钙超载、线粒体功能紊乱、细胞炎症、自噬、凋亡等诸多细胞与分子生物学机制有关，近年来自噬在缺血-再灌注中的作用越来越受到关注，越来越多的证据表明，自噬参与了脑缺血缺氧的过程(包括全脑缺血和局部缺血)^[1-2]。有研究显示亚低温可以改善缺血缺氧性脑损伤及创伤性脑损伤^[3]。目前已知，亚低温通过降低脑代谢率、抑制兴奋性氨基酸的释放、抑制酶的活性(NOS)，抑制自由基的生成及释放、减轻钙离子内流、抑制炎症介质与细胞因子的产生、促进细胞间信号传导的恢复等途径发挥脑保护作用。既然亚低温治疗脑损伤有效，且自噬又参与了缺血-再灌注损伤这一病理生理过程。亚低温如何调控自噬，目前尚未见到报道。因此本研究拟探索亚低温如何通过调控自噬发挥缺血-再灌注性脑损伤的保护作用，为研究亚低温改善CPR后脑损伤提供理论依据。

购买6~8周C57雄性小鼠，体质量20~30 g，由中山大学实验动物中心提供，动物许可证号：粵20150029，合格证号No.44008500011874。10%戊巴比妥腹腔注射0.5 mL/100 g，麻醉后常规消毒颈部皮肤，待小鼠无翻正反射后仰卧于手术台上，保持呼吸道通畅，经颈部做正中切口，切开皮肤，钝性分离皮下组织，分离胸锁乳突肌，暴露颈动脉鞘，然后仔细分离双侧颈总动脉及迷走神经，于颈总动脉下穿0号丝线，备用。提拉丝线，用无创性微动脉血管夹夹闭双侧颈总动脉造成全脑缺血缺氧，激光多普勒血流检测仪测定脑血流下降至正常10%，提示造模成功。阻断脑血流10 min之后松开双侧血管夹使之恢复脑灌注。分别在再灌注6、12、72 h不同时间点麻醉处死小鼠，根据不同实验要求选用不同方法取大脑标本，用于后续实验。亚低温的方法：调温毯调控小鼠体温，正常体温组保持体温37 ℃，亚低温组调至34 ℃，并置于恒温箱中维持体温，用体温探测仪持续探测肛温。

C57小鼠共96只，随机(随机数字法)分为8组(n)=12)：① 正常对照组(C0)；② 假手术组(sham)；③ I/R后6 h 组(C6 h)；④ I/R后12 h 组(C12 h)；⑤ I/R后72 h 组(C72 h)；⑥ I/R后6 h 亚低温组(C6 h+MH)；⑦ I/R后12 h亚低温组(C12 h+MH)；⑧ I/R后72 h亚低温组(C72 h+MH)。

取100 mg小鼠脑组织，液氮研磨后，加100 μL蛋白裂解液(RIPA)及1%蛋白酶抑制剂(PMSF)/磷酸酶抑制剂(PI)/ PHI，冰上进行，超声裂解；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，将上清液移入新EP管。取2 μL上清液用于BCA法(中国碧云天公司)测蛋白浓度。根据蛋白浓度及上样量(20 μg)，计算上样缓冲液(按25%的5×SDS，loading buffer)及双蒸水的量，配好后用98 ℃水煮变性后分装，置于-80 ℃冰箱保存，避免反复冻融。根据蛋白相对分子质量的大小选择配制合适的分离胶(小分子12%，中分子10%，大分子8%)，SDS-PAGE电泳，80 V 电压开始电泳，待蛋白进入分离胶后调整电压到120 V，根据Marker条带所处位置确定终止电泳时间。调节电流在300 mA，依据目的蛋白相对分子质量大小调整转膜时间，将PVDF膜放入5%BSA封闭液室温封闭1 h，再分别孵浴一抗和二抗，将显色液A、B液避光按1: 1混匀，将PVDF膜从TBST中取出，滴加显色液，用化学发光仪进行曝光显影。Sirt1、P-FoxO1、Rab7、P53一抗(英国Abcam公司)，Beclin1、LC3、β-actin一抗及兔抗大鼠二抗(美国Cell Signaling Technology公司)。

再灌注12 h后，将小鼠麻醉，多聚甲醛灌注，取脑组织，蔗糖沉淀，制作石蜡切片，放4 ℃冰箱备用；二甲苯Ⅰ脱蜡30 min，二甲苯Ⅱ脱蜡10 min；梯度乙醇复水：100%乙醇3 min，100%乙醇3 min，95%乙醇3 min，85%乙醇3 min，75%乙醇3 min，50%乙醇3 min，蒸馏水3 min，蒸馏水3 min，PBS 5 min；抗原修复：将切片置于0.1 mol/L且pH=6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉100火力加热3 min至微沸，再用50火力维持7 min，停止加热后自然冷却20~30 min。用PBS洗3 min，用滤纸擦去标本外的PBS，滴加封闭液，在湿盒中37 ℃封闭30 min；用滤纸擦去封闭液，勿洗。滴加LC3一抗(1: 100) 置湿盒中4 ℃孵育过夜，再用PBS 3 min×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS；滴加荧光二抗，室温置湿盒中避光孵育1 h，用PBS 3 min×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS；滴加NeuN避光孵育3 min，用PBS 1 min×3次洗去NeuN，用滤纸擦去标本外的PBS；最后用含甘油封片，并在荧光显微镜下观察。

再灌注72 h后，将小鼠麻醉，用4%多聚甲醛，PBS漂洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋固定，取海马区进行切片，制备石蜡切片，取石蜡切片进行烤片(60 ℃，1 h)后置室温备用；石蜡切片常规脱蜡复水(二甲苯和梯度乙醇)；0.01 mol/L PBS洗片5 min，2次；蛋白酶K(100 μg/mL，用10 mmol/L Tris-HCL配制，pH 7.4~8.0)37 ℃消化30 min；0.01 mol/L PBS洗片5 min，2次；0.2% TritonX-100透化处理20 min；0.01 mol/L PBS洗片5 min，2次；加50 μL TUNEL反应混合液(酶溶液与标记液按1: 9混合)，避光湿盒，37 ℃恒温箱放置60 min；0.01 mol/L PBS洗片5 min，3次；加NeuN染神经元细胞核3 min；0.01 mol/L PBS洗片5 min，3次；倒置荧光显微镜下检测凋亡，计算凋亡率：凋亡率=(TUNEL阳性细胞数/总细胞数)×100%。

用SPSS 13.0进行数据分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示，多组间计量资料比较用单因素方差分析(LSD-t)，以P < 0.05为差异有统计学意义。

正常体温组小鼠全脑缺血-再灌注损伤后，Sirt1蛋白表达随着时间延长逐渐减少，12 h更明显，与正常对照组比较，Sirt1蛋白表达减少(P < 0.05)；P-FoxO1表达也逐渐减少(P < 0.05)；Rab7表达逐渐减少(P < 0.05)；Beclin1表达减少(P < 0.05)；LC3Ⅱ/Ⅰ比值减少(P < 0.05)；而P53表达明显增加(P < 0.05)，见图 1。

n=6, 与对照组比较，aP < 0.05 图 1 正常体温组小鼠全脑缺血-再灌注后神经元自噬相关蛋白表达 Figure 1 The expression of Sirt1, P-FoxO1, Rab7, Beclin1, LC3 and P53 in NT

图选项

与正常体温组比较，再灌注后12 h，亚低温组Sirt1、P-FoxO1、Rab7、Beclin1，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达均高于正常体温组(P < 0.05)；而P53蛋白表达低于正常体温组(P < 0.05)，见图 2。

n=6, 与对照组比较，aP < .05，与C12 h组比较，bP < 0.05 图 2 亚低温对小鼠全脑缺血-再灌注后神经元自噬相关蛋白表达的影响 Figure 2 The expression of Sirt1, P-FoxO1, Rab7, Beclin1, LC3 and P53 in MH

图选项

缺血-再灌注损伤后12 h，神经元细胞LC3颗粒较正常对照组明显减少(P < 0.05)；而亚低温组LC3颗粒较正常体温组增多(P < 0.05)，见图 3。

n=6, 与对照组比较，aP < 0.05，与C12 h组比较，bP < 0.05 图 3 免疫荧光检测缺血-再灌注后神经元LC3颗粒表达的情况 Figure 3 The expression of LC3 after I/R by immunofluroscence

图选项

TUNEL检测结果显示，正常对照组、C72 h正常体温组及亚低温组，神经元凋亡率分别为(5.5±1.2)%、(54.8±7.5)%、(28.8±4.5)%，缺血-再灌注损伤72 h后，神经元细胞凋亡较正常对照组明显增多(P < 0.05)；而亚低温组神经元凋亡较正常体温组减少(P < 0.05)，见图 4。

n=6, 与对照组比较，aP < 0.05，与C72 h组比较，bP < 0.05 图 4 TUNEL检测缺血-再灌注后神经元凋亡情况 Figure 4 The apoptosis of cerebral CA1 of hippocampus after I/R by TUNEL

图选项

自噬是细胞对营养底物缺乏时的一种适应性反应，在缺血-再灌注等各种因素刺激下，细胞启动自噬来提高对缺血缺氧的耐受性，对细胞起到一定的保护作用。全脑缺血-再灌注损伤后自噬水平及其作用到底如何，目前仍存在争议，既往有文献报道I/R后自噬被激活，其模型为至少20 min以上的全脑缺血^[4]，或永久性局灶性缺血^[5-6]，缺血时间在90 min左右，时间较长，这种严重的脑缺血缺氧后自噬过度激活导致神经元细胞自噬性死亡，而本研究的模型为短暂性可逆性全脑缺血，时间相对较短，表现为自噬水平不足，凋亡增多。

Beclin1基因是由美国科学家于1998年发现的第一个哺乳动物自噬相关基因6(autophagy gene，Atg 6)，是哺乳动物参与自噬的特异性基因，Beclin 1与自噬、凋亡的调节均有关^[7]。LC3是一种自噬标志物，也是自噬相关基因8(Atg8)，自噬形成时，胞质型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3 Ⅱ)，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估计自噬水平的高低，目前检测自噬的常用方法是蛋白免疫印迹检测LC3的转换及免疫荧光观察LC3点状聚合物的形成。因此，本研究选择Beclin1和LC3进行检测，发现小鼠全脑缺血-再灌注损伤后，自噬相关基因及蛋白均表达减少，免疫荧光结果发现LC3颗粒也减少，TUNEL显示神经元凋亡增加，说明缺血-再灌注后自噬明显不足，凋亡增多。因此可以推测I/R后适度的自噬可以清除受损细胞器，为其他脑组织提供能量，对脑损伤有一定的保护作用，若自噬不足，可以进一步促进凋亡。文献报道，自噬可能是脑缺血预处理发挥保护作用的机制之一。在成年大鼠短暂性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)前进行高压氧预处理^[8]以及在永久性MCAO前进行短暂性缺血预处理^[9]，可使缺血后LC3水平升高和自噬体数量增加，或使缺血缺氧后自噬持续时间延长，起到脑保护作用；给予自噬抑制剂3-MA可抑制缺血预处理诱导的自噬及保护作用，而给予自噬诱导剂雷帕霉素可以增加预处理的保护作用。

Sirt1(silent information regulator of transcription 1) 是一种组蛋白去乙酰化酶，是细胞内重要的能量感受器，可对不同的能量需求做出相应反应。Sirt1-FoxO(forkhead transcription factor，FoxO)通路对糖尿病、衰老、肥胖、肿瘤、心血管疾病等具有重要影响^[10-11]。近年，Sirt1和FoxO1在缺血-再灌注损伤中亦有相关研究。Sirt1对FoxO的去乙酰化调节，在细胞自噬调控中具有重要作用，Sirt1大量存在于神经系统，具有重要的神经保护作用。本研究发现I/R后Sirt1、FoxO1表达不足，且自噬不足，凋亡增加，推测Sirt1、FoxO1在I/R后自噬和凋亡的发生中有重要调节作用。Raval等^[12]发现缺血预处理以及应用Sirt1激动剂白藜芦醇可以减少全脑缺血缺氧后大鼠海马CA1区的神经元损伤，说明上调Sirt1活性可能是缺血预处理和白藜芦醇保护神经元损伤的共同机制。可见，Sirt1和FoxO1参与了缺血-再灌注损伤过程中的自噬调控。

P53是一种重要的抑癌基因，有“分子警察”的称号，能够调控细胞周期，促进凋亡，防止肿瘤发生，最近发现P53也是一种自噬的主要调控因子。越来越多的证据表明，P53可以双重方式调控细胞自噬，其取决于它在亚细胞之定位^[13]。一方面，P53是一种核转录因子，有遏制细胞周期和促凋亡的作用；另一方面，细胞质P53能在线粒体内进行操控，以抑制细胞自噬。可见，自噬和凋亡之间存在密切的联系。本研究发现，I/R后P53表达有所增加，说明P53参与了缺血-再灌注损伤过程的神经元自噬和凋亡。

应用亚低温干预后，发现Sirt1、FoxO1表达明显增加，Beclin1表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值也增加，而P53表达减少，因此推测亚低温干预可能通过上调Sirt1的活性，增加FoxO1、Rab7和自噬相关基因Beclin1、LC3的表达，同时抑制P53，促进神经元自噬，减少凋亡。机体处于亚低温时，可以降低糖、脂肪的代谢速率，使细胞内ATP水平适度降低，进而激活AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，启动级联反应，AMPK和Sirt1两条通路之间存在着交叉网络联系^[14]，进一步激活Sirt1，进而促进自噬，清除受损细胞器，为其他细胞提供能量。

综上所述，本研究发现小鼠全脑缺血-再灌注损伤后，神经元自噬减少，凋亡增加，而亚低温干预可以促进自噬，减少凋亡，为缺血-再灌注后脑损伤提供新的治疗靶点，为亚低温发挥脑保护作用提供有力的理论依据。