急性有机磷中毒(acute organic phosphorus poisoning, AOPP)为目前临床中常见农药中毒。据报道,中国每年约有4~7万人因有机磷中毒就诊,虽然目前已经有特效解毒剂,但是在临床上的病死率仍达10%左右。在大剂量有机磷中毒出现死亡的患者中,往往合并有急性肾功能损伤。在以往的研究过程中,关注点集中在有机磷所造成的神经系统,呼吸系统和消化系统损伤,而忽视了有机磷所造成的肾脏损伤[1-2]。因此本实验预进行有机磷肾损伤及保护方面的研究,以期为减少有机磷中毒所造成肾损伤,提高大剂量有机磷中毒的患者生存率及预后提供一个新的方法。
对氧磷酶-1(paraoxonase -1, PON-1),是近年来被发现的一种可以水解有机磷的酶,可以由哺乳动物合成[3-5]。本研究目的是探讨PON-1对于敌敌畏所致的大鼠肾损伤的保护作用。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物取健康的成年雄性SD大鼠30只,SPF级,体质量为250~300 g,购自北京华阜康生物科学技术有限责任公司,由中国科大学附属盛京医院动物实验中心饲养。
1.1.2 主要试剂及仪器兔血清PON-1由中国医科大学中心实验室使用层析分离纯化(使用南京建成公司对氧磷酶-1浓度试剂盒测试浓度)以供使用[6]。尿素氮肌酐检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司),肾损伤分子-1(KIM-1)、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)、胱抑素-C(Cys-C)(抗体为abcam公司生产,上海商红生物科技有限公司包被ELISA试剂盒)。CX-41普通光学显微镜(日本OLYMPUS公司);E800型生物光学显微镜照相机(日本Nikon公司)。
1.2 方法 1.2.1 动物模型的制备将30只大鼠随机(随机数字法)分成5组,每组6只。正常组(A组)、染毒组(B组)、PON-1预处理组(C组)、传统阿托品加解磷定治疗组(D组)、联合治疗组(E组)。A组予大鼠腹腔注射与敌敌畏同等体积的生理盐水;B组予大鼠腹腔注射敌敌畏9 mg/kg制备染毒实验组,并观察症状;C、D、E组均予大鼠腹腔注射敌敌畏9 mg/kg。C、E组在腹腔注射敌敌畏前30 min,予大鼠尾静脉注射PON-1 4 500 U/kg,D、E组注射敌敌畏后予大鼠碘解磷定45 mg/kg,阿托品10 mg/kg腹腔注射[7]。
1.2.2 取材各组大鼠在造模12 h后使用代谢笼收集尿液,以3 500 r/min离心10 min离心后,取上清液冷冻于-80 ℃冰箱,以备进行ELISA检测NAG及KIM-1。使用10%水合氯醛以0.03 mL/kg进行腹腔注射麻醉,颈内动脉插管取动脉血,以3 500 r/min离心10 min,取上清液冷冻于-80 ℃。检测血清尿素氮、肌酐、胆碱酯酶(ChE)及胱抑素-C(Cys-C)。大鼠处死后开腹,取新鲜肾脏浸泡于4%多聚甲醛中固定,以备组织学光镜检查。
1.2.3 光镜检查取肾组织经固定、脱水、透明及包埋后切片、HE染色,树脂封片,光镜下观察肾脏组织学形态。
1.2.4 大鼠血清Cys-C及尿KIM-1、NAG检测采用ELISA法,在96孔板上设好各孔位置后加样,孵育、弃液、甩干、洗涤后,依次滴加待测溶液,再滴加底物溶液避光显色,终止显色后,在酶标仪450 nm波长下测量吸光度。
1.2.5 大鼠血浆肌酐水平检测使用苦味酸法,血清中的肌酐与碱性苦味酸反应,生成黄红色的苦味酸肌酐复合物,在510 nm波长处进行比色测定。吸光度的升高与肌酐含量成正比。
1.2.6 大鼠血浆尿素氮水平检测使用脲酶法,尿素在脲酶作用下分解生成氨。在碱性条件下,经次氯酸氧化生成的氯胺与苯酚被亚硝基铁氰化钠催化生成蓝色的靛酶。使用分光光度仪测定各个实验管内的吸光度,计算尿素含量。
1.2.7 大鼠血浆胆碱酯酶水平检测使用比色法测定,水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸,胆碱可以与巯基显色剂反应生成对称三硝基苯(TNB)黄色化合物,根据颜色深浅进行比色定量,水解产物胆碱的数量可反映胆碱酯酶的活力。
1.3 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理。计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,组间比较采用SNK-q法进行检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠一般情况各组大鼠处理12 h后至麻醉前观察一般情况。A组大鼠生命活动正常,未出现肢体抽动及流涎等症状;B组大鼠约1~5 min后即出现肢体抽动,四肢肌肉震颤,流涎及大小便失禁等急性中毒的症状;C组大鼠出现轻微的咀嚼肌及四肢骨骼肌震颤,但症状很快消失,未见明显的流涎及二便失禁症状;D组大鼠出现咀嚼肌抽动及四肢肌肉震颤,出现流涎症状,但很快消失,未见明显的大小便失禁症状; E组大鼠出现轻微的咀嚼肌震颤,但很快消失,未见流涎二便失禁等症状。染毒组大鼠出现流泪流涎,大小便失禁,肌颤,萎靡,反应迟钝等典型的敌敌畏中毒症状。
2.2 BUN、Cr、KIM-1、NAG、Cys-C、ChE活性B组大鼠的BUN和Cr水平均高于其余各组,且差异有统计学意义(P < 0.05),其余各组间差异无统计学意义,A组、C组和E组的KIM-1、NAG和Cys-C指标差异无统计学意义,其与B组和D组指标差异有统计学意义(P < 0.01),见表 1~2。
组别 | KIM-1(mg/L) | NAG(U/L) | Cys-C (mg/L) |
A组 | 1.29±0.64 | 35.51±10.22 | 107.25±29.34 |
B组 | 4.97±0.51 a | 144.62±10.63 a | 148.61±16.44 a |
C组 | 1.82±0.80 | 46.73±12.80 | 94.98±18.36 |
D组 | 4.29±0.78 b | 130.08±18.43 b | 151.70±0.77 b |
E组 | 2.21±0.42 | 41.69±15.96 | 103.05±18.89 |
注:A组为正常组,B组为染毒组,C组为PON-1预处理组,D组为传统解救组,E组为联合治疗组;与A组比较,aP < 0.01,bP < 0.05 |
组别 | 胆碱酯酶(U/L) | BUN (mmol/L) | Cr (μmol/L) |
A组 | 4 768.50±34.96 | 4.77±1.46 | 63.22±10.37 |
B组 | 434.50±158.52 a | 6.06±0.56 a | 123.28±22.51 a |
C组 | 3 915.67±148.83 | 4.95±0.64 | 66.38±9.60 |
D组 | 1 754.83±369.29 a | 5.09±0.76 a | 74.28±11.17 a |
E组 | 3 936.67±154.83 | 5.02±0.78 | 67.96±13.07 |
注:A组为正常组,B组为染毒组,C组为PON-1预处理组,D组为传统解救组,E组为联合治疗组;与A组比较,aP < 0.05 |
B组大鼠肾脏炎性细胞广泛浸润,细胞充血水肿严重,管腔闭塞,刷状缘消失,已无法找到明确的小管结构(图 1B),D组肾脏仍然出现小管细胞变性水肿,炎性细胞浸润,较染毒组有所减轻,可见明确小管结构,管腔未完全闭塞,并且以远曲小管病变最为严重(图 1D)。C组及E组仅有轻度充血、水肿,无明显的细胞变性坏死(图 1C)。A组肾小管上皮结构清楚,可见刷状缘,管腔内无管型及坏死的细胞碎片(图 1A)。
3 讨论敌敌畏是常用的有机磷农药,其中毒机制为使胆碱酯酶磷酰化进而抑制其活性,使其丧失水解乙酰胆碱的能力,进而使体内乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)蓄积,产生毒蕈碱样、烟碱样及神经系统症状。本研究中,经腹腔注射敌敌畏的染毒组大鼠出现流泪、流涎、肌束震颤、大小便失禁等典型的敌敌畏中毒症状。
在本实验研究过程中,染毒组(B组)大鼠尿液的NAG、KIM-1和血清中的Cys-C,BUN和Cr水平较生理盐水对照组(A组)有显著升高,这表明了敌敌畏可以造成大鼠的急性肾小管损伤。NAG是近端肾小管溶酶体,是一种灵敏并且能持续表达的肾小管损伤指标;KIM-1是一种跨膜糖蛋白,在肾脏正常组织中一般不表达,但是在缺血或肾毒性肾损伤时,它在近端肾小管上有明显的表达[8]。在NAG和KIM-1的联合检测中提示敌敌畏对于大鼠肾脏的损伤主要集中在肾小管上皮上[9]。本研究通过大鼠肾脏光镜病理,发现大鼠的肾小管上皮出现很严重的炎症反应,并出现了肾小管上皮细胞出现炎性细胞浸润,肾小管上皮细胞肿胀,肾小管闭塞,提示有机磷中毒所导致的肾损伤以肾小管损伤为主。但是同时大鼠的尿BUN、Cr和Cys-C水平也出现升高,提示大鼠同时也出现了肾小球滤过率的下降,考虑该表现可能与肾小管损伤后肾脏间质水肿,进而导致肾小球滤过压平衡点出现移动,导致肾小球滤过率下降有关。
除此之外,在有机磷中毒导致的肾损伤可能的机制还有:(1) 有机磷中毒时,因其可激动M受体,进而导致平滑肌痉挛,括约肌松弛,腺体分泌增加导致体液的大量丧失,进而导致机体有效循环血容量下降、肾脏灌注不足、超过肾脏自身调节能力,进而尿中可出现蛋白、管型及细胞等肾前性肾功能不全的表现,持续灌注不足时可导致肾性肾功能不全;(2) 有效血容量下降,不仅可以直接引起肾脏灌注不足,同时也可以刺激肾小球旁细胞大量分泌肾素,引起肾素血管紧张素系统激活,进一步加重了肾脏入球小动脉收缩、痉挛,肾缺血,进而致使肾小管缺血坏死;(3) 中毒后乙酰胆碱不能被有效降解,体内大量的乙酰胆碱蓄积,进而引起全身症状,包括呼吸衰竭,循环衰竭,使得肾脏血管痉挛加重,肾脏缺血加重,进而加重肾脏的损伤;(4) 敌敌畏农药主要通过皮肤和消化系统代谢,但是仍有相当一部分毒物是通过肾脏代谢的,在经肾脏排泄过程中,在肾脏中起生物学活性的很多酶类被灭活,使得肾脏功能受损;(5) 有机磷农药在人体内除了可以抑制胆碱酯酶活力,还可以造成血管系统的损伤,尤其是肾脏毛细血管损伤,使得毛细血管壁受损,血管内皮暴露,释放大量的凝血物质,迅速形成血管内凝血,加重肾小管的坏死病变,发展成不可逆的肾功能衰竭[10-12]。
对氧磷酶-1(PON-1) 为一种由哺乳动物肝脏合成并释放入血的酶,其广泛存在于哺乳动物的血浆中,以血浆和肝脏中的PON-1活性最强。其可以保护机体之中的脂蛋白不被氧化,清除氧自由基。同时PON-1还可以通过水解有机磷的磷酸键进而水解有机磷使其丧失活性[13-16]。在哺乳动物中,家兔血清的PON-1热稳定性、催化水解有机磷反应的效率最高[17]。在实验中,染毒组(B组)大鼠的相关指标较生理盐水对照组(A组)有显著升高,而PON-1组(C组)大鼠相关指标较染毒组下降明显,较生理盐水对照组(A组)差异无统计学意义。传统阿托品加解磷定组(D组)相关指标较染毒组有所下降,下降幅度不及PON-1组(C组)。阿托品、解磷定联合PON-1解救组(E组)与单独PON-1解救组(C组)相比,差异无统计学意义。表明PON-1可以有效地减轻敌敌畏对于大鼠所造成的损害,并且单独应用及与传统解救药物联合应用差异无统计学意义,这表明PON-1可以单独应用于有机磷中毒的解救,这样不仅可以提高治疗效果,也可以减少阿托品及肟类复能剂的使用,避免了阿托品中毒及肟类复能剂不良反应的发生。同时由于PON-1组与生理盐水对照组差异无统计学意义,也表明PON-1不会引起肾脏损伤,在应用上是安全的[18-19]。
综上所述,家兔血清PON-1不会造成大鼠的肾损害,同时可以通过水解磷酸酯键进而减轻敌敌畏中毒所引起的急性肾损伤,可以作为一条治疗急性有机磷中毒所引起肾损伤的新途径。
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