2017, Vol. 26
百草枯(paraquat，PQ)中毒会引起全身多系统损伤，尤以肺为甚，研究认为百草枯结构类似多胺，可被肺泡上皮多胺转运系统特异性转运，使得其在肺内大量聚集，故肺内浓度比血浆浓度高10~90倍[1]。所以百草枯中毒以急性肺损伤为突出表现，目前尚无特效解毒药，故患者预后差，致残率和病死率高。因此研究百草枯中毒引起的肺损伤对降低PQ中毒的病死率具有重要意义。关于百草枯的致病机制目前仍然在探索中，大量实验证实毒性氧自由基在百草枯中毒导致肺损伤中起主要作用[2-4]。因此，寻找对抗百草枯诱导的氧化应激的分子靶标和通路成为目前治疗百草枯中毒导致急性肺损伤的研究热点。
Nrf2-ARE通路与多种肺部氧化应激性疾病密切相关[5-10]。该通路诱导的多种抗氧化酶能对抗ROS引发的氧化应激，保护正常细胞不受其破坏。因此，调控Nrf2-ARE信号通路可能是预防和治疗百草枯中毒致急性肺损伤的重要手段和方法。硫辛酸(alpha lipoic acid, α-LA)因其分子终端含有的羧基和本身具备的大量碳原子，使其具有比维生素E更强的水溶性，且更易溶于脂质，是目前发现唯一兼具脂溶性与水溶性且能够自由进入细胞内的天然抗氧化剂。其本身及代谢产物二氢硫辛酸主要通过直接清除活性氧和生成内源性抗氧化剂发挥强大的抗氧化作用。本研究采用百草枯中毒致急性肺损伤模型，观察肺组织Nrf-2及其HO-1表达及其介导的GSH-Px、SOD活力变化，并通过硫辛酸干预探讨其保护机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级健康雄性Sprage-Dawley (SD)大鼠，共72只，体质量200~250 g，由武汉大学动物中心提供，实验动物质量合格证号为NO.00020528，许可证号为SCXK (鄂)2008-0004。购入后饲养于华中科技大学同济医学院动物中心SPF实验室，所有大鼠均严格遵守实验动物伦理道德法则并给予相同的饲料和饲养条件。
1.2 主要仪器和试剂电热恒温培养箱(上海福玛医疗仪器制造有限公司)；倒置显微镜(Olympus公司XDS-1型)；5810R冷冻型台式大容量高速离心机(Eppendorf Gene Company)；普通台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；电子分析天平BP109S (德国Sarterius公司)；紫外分光光度计UV751GD (上海精密科学仪器有限公司)；-80 ℃低温冰箱(德国Harrs公司)；全自动酶标免疫分析仪(Bio-Tex Instruments)。20%百草枯溶液(先正达南通作物保护有限公司)；硫辛酸(LA)注射液(亚宝药业太原制药有限公司)；兔抗鼠Nrf-2多克隆抗体(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.)；兔抗鼠HO-1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；辣根过氧化物酶标二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；10%水合氯醛(武汉协和医院儿科)；谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒及超氧化物歧化酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.3 动物分组及模型建立随机(随机数字法)分为正常组(n=12)、百草枯中毒组(PQ组，n=30) 和百草枯中毒+硫辛酸干预组(LA组，n=30)，正常组分为6 h和72 h亚组，PQ组和LA组动物按观察时点6 h、12 h、24 h、48 h、72 h随机分成5个亚组，每个亚组6只。20%PQ溶液配置成浓度10 mg/mL溶液，避光保存。正常组以等量的生理盐水腹腔注射，PQ组以百草枯25 mg/kg一次性腹腔注射染毒，LA组在给予百草枯25 mg/kg一次性腹腔注射染毒0.5 h后尾静脉给予LA 100 mg/kg[11]，为保证实验动物血药浓度的稳定性，24 h、48 h、72 h各个亚组分别于每日上午9~10点间尾静脉给予LA 100 mg/kg，直至处死时为止。
1.4 标本收集及处理10%水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉，固定后取出完整两侧肺组织，称量并记录肺湿质量。取左肺叶4%多聚甲醛固定，石蜡包埋行病理检测，右肺叶放入冻存管后立即置液氮中速冻，后置于-80 ℃冰箱保存以检测酶学指标。
1.5 大鼠体质量及肺系数测定肺系数=肺质量(mg)/体质量(g)
1.6 肺组织大体变化及Nrf-2，HO-1蛋白的表达观察观察各组肺组织大体形态变化，进行对比。左肺组织用4%多聚甲醛固定12 h后，石蜡包埋切片，常规HE染色于光镜(×200) 下观察肺组织病理学变化。此外石蜡切片脱蜡，PBS液洗，进行抗原修复，加封闭用山羊血清工作液，PBS液洗，加一抗(兔抗鼠Nrf-2抗体，稀释度1: 400；兔抗鼠HO-1抗体，稀释度1: 100)，4 ℃置于湿盒过夜，PBS液洗，依次加入二抗(生物素化羊抗兔子)，加三抗(辣根过氧化物酶标记链酶亲和素)(S-A/HRP)，再加3, 3-二氨基联苯胺(DAB)显色，封片。免疫组化结果判断：各个时间点随机抽取切片5张，200倍光镜下随机选取5个互不重叠视野，用显微图像分析系统计算阳性表达区域的阳性系数(阳性系数=染色强度得分+阳性细胞率得分)。各个时间点取平均值后进行统计学比较。
1.7 酶学指标GSH-Px、SOD活力测定取右肺组织，制备1%肺组织匀浆，放置冰上，按照试剂盒说明书。通过5, 5-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)直接比色法测定GSH-Px活力，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。
1.8 统计学方法采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。两组间比较采用SNK-q检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 大鼠中毒表现观察正常组大鼠无中毒表现。PQ组大鼠在一次性腹腔注射PQ约30 min后，逐渐出现中毒反应表现，表现为进食进水减少、倦怠、嗜睡、行动迟缓、攻击性降低；呼吸急促、张口呼吸、甚至呈点头样呼吸；口周及鼠尾发绀；鼠毛竖立、色泽黯淡，肢体无力、腹泻，眼、口、鼻可见红色血性分泌物等。中毒表现以24~72 h时最重。LA组大鼠染毒后也出现中毒反应，但24 h后中毒反应表现较同时间点PQ组明显减轻。
2.2 大鼠体质量及肺系数变化各组大鼠体质量及肺系数变化见表 1。
| 组别 | 只数 | 时点 | 体质量(g) | 肺系数(mg/g) |
| 正常组 | 6 | 6 h | 220.83±6.85 | 4.59±0.10 |
| 6 | 72 h | 274.67±9.87 | 4.31±0.51 | |
| PQ组 | 6 | 6 h | 218.53±4.67 | 4.98±0.49 |
| 6 | 12 h | 203.57±5.15b | 6.06±0.31b | |
| 6 | 24 h | 191.32±9.60 b | 7.39±0.53b | |
| 6 | 48 h | 183.85±2.07b | 8.48±0.23b | |
| 6 | 72 h | 173.13±4.34b | 9.06±0.10b | |
| LA组 | 6 | 6 h | 216.10±5.97 | 4.93±0.39 |
| 6 | 12 h | 202.77±7.13b | 5.80±0.34b | |
| 6 | 24 h | 200.65±9.80b | 6.83±0.48bd | |
| 6 | 48 h | 191.02±0.82bd | 7.61±0.28bd | |
| 6 | 72 h | 183.37±7.74bc | 8.29±0.36bd | |
| 注：与正常组比较，aP＜0.05, bP＜0.01;与PQ组比较，cP＜0.05, dP＜0.01 | ||||
正常组大鼠双肺叶组织呈均匀淡红色，表面光滑、质软、弹性好，无出血、水肿及梗死灶。PQ组大鼠中毒后6 h后即有病理改变，可见散在点状出血点，体积大致正常。随着时间延长逐渐可见普遍性肺淤血，边缘圆钝，充血肿胀明显，体积增加，表面可见散在点片状或灶状出血灶，部分可见弥漫性出血点，片状透明样变或暗红/粉红色相间。48~72 h肺损伤程度最重，甚至出现实质肝样变性。LA组大鼠肺组织大体病理损伤范围及程度在12~72 h时间点明显较PQ组轻微。
正常组大鼠HE染色可见肺组织结构清晰完整，肿泡结构完整，肺泡壁簿，间隔无增厚，肺泡腔几乎无炎性细胞浸润。PQ组HE染色6 h即肺毛细血管扩张，充血，肺泡管壁，支气管腔面，肺泡隔以及部分肺泡腔内可见少量炎症细胞浸润，肺泡间隔增宽，随着时间延长，其病理损伤逐渐加重，表现为肺泡腔内出现粉红色的渗出液和红细胞聚集、甚至肺泡腔结构破坏，肺泡塌陷，大部分肺泡融合，48 h和72 h呈高峰。LA组各时间点大鼠HE染色，其病理损伤程度较PQ组明显减轻(图 1)。
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| 图 1 大鼠肺组织病理变化(HE×200) Figure 1 The pathological changes of lung tissue of rats in each group (HE×200) |
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PQ组大鼠肺组织中Nrf-2表达明显强于正常组，在各级肺泡上皮细胞及炎症细胞均有着色，呈棕色或棕褐色颗粒状，为中度阳性表达。PQ和LA组Nrf-2平均阳性系数在5个时间点均明显高于正常组(P＜0.01)。LA组在48、72 h时间点高于PQ组，差异有统计学意义(P＜0.01) (图 2)。PQ组大鼠肺组织HO-1表达在72 h较正常组表达减少(P＜0.01)，LA组HO-1阳性系数在72 h明显高于PQ组，差异有统计学意义(P＜0.05) (图 3)。其余时间点差异无统计学意义(P>0.05)。
| 组别 | 只数 | 时点 | Nrf-2阳性系数 | HO-1阳性系数 |
| 正常组 | 6 | 6 h | 0.83±0.11 | 1.73±0.11 |
| PQ组 | 6 | 6 h | 3.26±0.33b | 2.03±0.16 |
| 6 | 12 h | 3.07±0.50b | 2.02±0.31 | |
| 6 | 24 h | 2.64±0.42b | 1.79±0.20 | |
| 6 | 48 h | 1.33±0.22b | 1.49±0.24 | |
| 6 | 72 h | 1.62±0.41 | 1.31±0.15b | |
| LA组 | 6 | 6 h | 3.27±0.25b | 2.19±0.23 |
| 6 | 12 h | 3.62±0.40b | 2.05±0.41 | |
| 6 | 24 h | 3.59±0.55b | 1.68±0.14 | |
| 6 | 48 h | 3.99±0.50 bd | 1.89±0.17 | |
| 6 | 72 h | 3.51±0.12bd | 1.76±0.17c | |
| 注：与正常组比较，aP＜0.05, bP＜0.01;与PQ组比较，cP＜0.05, dP＜0.01 | ||||
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| 图 2 各组大鼠肺组织Nrf2免疫组化染色结果(SABC×400) Figure 2 The expression of Nrf2 in lung tissue of each group by immunohistochemical staining (SABC×400) |
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| 图 3 大鼠肺组织HO-1免疫组化染色结果(SABC×200) Figure 3 The expression of HO-1 in lung tissue of each group by immunohistochemical staining (SABC×200) |
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PQ组大鼠染毒后随着时间的延长抗氧化酶GSH-Px，SOD活力在12~72 h四个时点较正常组明显降低(P＜0.01)；SOD活力在五个时间点均较正常组明显降低(P＜0.01)，差异有统计学意义。LA组大鼠GSH-Px活力在24 h、48 h和72 h高于PQ组(P＜0.01, P＜0.05)；同时SOD活力在五个时间点均高于PQ组(P＜0.01)，差异有统计学意义(P＜0.01)。
| 组别 | 例数 | 时点 | GSH-Px (U/mg prot) | SOD (U/mg prot) |
| 正常组 | 6 | 6 h | 68.31±5.77 | 86.52±5.57 |
| PQ组 | 6 | 6 h | 61.62±5.84 | 56.09±5.65b |
| 6 | 12 h | 51.82±9.94b | 46.98±3.49b | |
| 6 | 24 h | 47.35±2.41b | 40.63±4.40b | |
| 6 | 48 h | 37.79±5.19b | 30.98±5.85b | |
| 6 | 72 h | 29.33±4.23b | 25.11±1.96b | |
| LA组 | 6 | 6 h | 63.07±3.69 | 67.48±5.68bd |
| 6 | 12 h | 54.70±7.63b | 57.05±4.47bd | |
| 6 | 24 h | 55.87±4.75bd | 50.70±4.47bd | |
| 6 | 48 h | 45.13±4.18bc | 42.16±2.93bd | |
| 6 | 72 h | 38.85±4.87bd | 57.92±7.95bd | |
| 注：与正常组比较，aP＜0.05, bP＜0.01;与PQ组比较，cP＜0.05, dP＜0.01 | ||||
研究显示百草枯进入肺内经NADPH辅助的单电子还原为自由基，并进一步分解形成多种自由基[12]，从而引起肺的氧化性损伤。Nrf-2是一种重要的内源性抗氧化应激的调节因子，是决定细胞内源性抗损伤能力的关键转录因子，在氧化应激反应中处于核心地位，具有抗氧化、抗炎症的作用；生理状态下Nrf-2定位于细胞浆，与细胞质接头蛋白(Kelch-like ECH associating protein 1, Keap-1) 结合形成复合物，当受到氧化应激等的刺激后，磷酸化进入细胞核，与抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)结合，进而诱导其调控的靶基因表达HO-1, GSH-PX，SOD，醌氧化还原酶1(NADPH:quinone oxidoreductase 1, NQO1) 等抗氧化和Ⅱ相解毒酶[13]，从而对抗ROS引发的氧化应激，保护正常的细胞不受其破坏, 在机体对抗氧化，外源性毒物损伤过程中起决定性作用[9]。而在Nrf-2诱导的抗氧化酶中，HO-1在机体或细胞遇到氧化剂或是伤害性刺激后最易诱导表达。相关研究表明Nrf-2缺乏可导致抗氧化酶的减少，造成小鼠模型对多种肺病易感[14]。在高氧导致的急性肺损伤中，Nrf-2及其诱导的下游表达产物可以起保护肺脏的作用，并且Nrf-2敲除小鼠比野生型小鼠在高氧诱导的肺损伤中表现出更明显的肺炎[15]。Surh等[16]研究结果发现，HO-1能通过抗氧化应激，从而保护细胞免受损害。
本研究采用25 mg/kg PQ腹腔注射，建立百草枯中毒致急性肺损伤模型[4, 17-18]。实验发现PQ组给予百草枯后大鼠表现一系列中毒症状，PQ组体质量也随着中毒时间的延长而逐渐下降。对肺组织病理结构观察，对照组大鼠肺组织结构正常；PQ组大鼠其HE染色病理形态符合急性肺损伤表现。除此，PQ组大鼠染毒后，各时间点肺系数较正常组不同程度增加，说明肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的通透性增加，出现不同程度肺水肿。以上几点表明本实验PQ致大鼠急性肺损伤模型是成功的，为实验顺利进展提供了良好基础。
本实验通过免疫组织化进行Nrf-2和HO-1在肺组织的半定量分析，在48 h、72 h两个时间点，LA组Nrf-2的表达明显高于PQ组，差异有统计学意义(P＜0.01)。在72 h，LA组HO-1的表达明显高于PQ组，差异有统计学意义(P＜0.01)。
SOD和GSH-Px是机体内重要的抗氧化酶，本研究结果显示PQ组大鼠在给予PQ染毒后机体SOD和GSH-Px的活力明显低于正常组，而LA组，SOD及GSH-Px的活力较PQ组明显增强，差异有统计学意义(P＜0.01)。并且两者表达基本与Nrf-2和HO-1的表达趋势基本一致。可见Nrf-2可结合抗氧化反应元件ARE诱导包括HO-1在内的多种内源性抗氧化酶的表达，在不造成过度抗氧化的条件下实现体内氧化还原再平衡[19]。Petersen Shay等[20]的实验证实LA能增加肝细胞核Nrf-2蛋白水平，并能诱导Nrf-2介导的抗氧化酶和二相解毒酶基因的表达，同时该实验表明给老年大鼠提供含有(R)-a-硫辛酸(40 mg/kg)的饮食两周后，增加了老年鼠肝脏细胞随着年龄增加而减少的GSH水平，能明显增加细胞合成GSH的能力。因此，LA可以看作是Nrf-2诱导基因表达的诱导剂[21]。而本研究结果亦表明，硫辛酸可以增加Nrf-2的表达，并能诱导Nrf-2介导的抗氧化酶HO-1、SOD和GSH-Px的表达，这与国外学者的研究相一致[20-21]。
综上所述，NRF2-ARE信号通路可能参与了百草枯致急性肺损伤的病理生理进程，而抗氧化剂硫辛酸的应用可提高百草枯致大鼠急性肺损伤模型中Nrf-2及HO-1的表达，起到保护百草枯肺的作用。
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