2017, Vol. 26
炎症/抗炎症反应、凝血/纤溶系统失衡在ARDS的发病过程中具有重要的作用[1]。蛋白C (Protein C, PC) 通路是机体抗凝系统的重要组成部分。PC是一种存在于血液中的维生素K依赖性糖蛋白酶，在凝血酶-血栓调节蛋白复合物作用下活化为APC。APC与辅助因子蛋白S结合，灭活因子Ⅴa和Ⅶa，限制凝血酶的产生。EPCR是蛋白C系统新发现的成员，EPCR提供了PC激活区域，进一步增强蛋白C向APC转化。EPCR参与凝血、炎症、凋亡、保护内皮屏障以及免疫等诸多病理过程，有研究发现与脓毒症和ARDS的发病有关[2-3]。近年来，发现一些基因的遗传变异与ARDS的发病相关[4-6]。有关凝血与纤溶通路基因的遗传变异与ARDS关联研究报道较少。本研究选择PC和EPCR为候选基因，探讨两个基因的单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 是否与ARDS的易感性和预后相关，并阐述其可能的机制。
1 资料与方法 1.1 一般资料收集2006年6月至2016年8月复旦大学附属中山医院急诊ICU诊断为ARDS患者275例和337例病例对照患者入选本研究。ARDS的诊断标准严格按照1994年AECC制定的诊断标准[7]。病例对照组为同期入住ICU、具有ARDS发病的高危因素，但未进展至ARDS的患者，主要包括脓毒症、肺部感染、吸入性肺炎、外伤、大量输血等危重患者。ARDS组和疾病对照组患者的入选标准为：① 年龄≥18周岁；② 符合ARDS的诊断标准或具有ARDS患病的高危因素；③ 中国汉族人群；④ 患者之间无血缘关系；⑤ 病史资料、临床实验室和辅助检查结果齐全。排除标准包括：① 患自身免疫性疾病或者获得性免疫缺陷病；② 恶性肿瘤；③ 近期接受化疗或者放疗；④ 患严重的慢性呼吸系统疾病；⑤ 严重的慢性肝脏疾病 (Child-Pugh评分>10分)。本研究获得复旦大学附属中山医院伦理委员会的批准 (No: 2006-23)。
收集患者ARDS诊断后24 h内的资料，包括：感染部位、血白细胞计数和分类、血小板计数、血糖、血肌酐、血氧分压、氧合指数等生化检测指标和体温、心率、血压、呼吸频率、主要的治疗措施等临床记录。收集入选者的人口学资料、吸烟状况、发病原因、就诊时间、用药史、慢性病史和家族史等资料。采用APACHE Ⅱ评分系统对患者的严重程度进行评价。
1.2 tagSNPs的选择和分型根据Hapmap中国人群数据库选择PC和EPCR 2个基因的tag SNPs，共选择5个tagSNPs进行研究 (PC基因-rs1799809, rs1158867, rs2069912；EPCR基因-rs2069948，rs867186)。采用SNPstream的方法 (Beckman技术平台) 对SNP位点进行检测和分型。根据检测到的杂交反应荧光的不同，判断相应样本SNP等位基因型。
1.3 外周血的分离和ELISA测定APC浓度为进一步探讨rs1799809基因型对APC浓度的影响，收集51例rs1799809不同基因型的ARDS患者、入院24 h内的外周静脉血5 mL、肝素抗凝，室温下放置30 min后，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液-80 ℃保存备用。采用ELISA方法对血浆中APC浓度进行检测。ELISA测定试剂盒购自美国Sigma公司，具体操作步骤按说明书进行。
1.4 统计学方法计量数据以均数±标准差 (x±s) 表示，各组之间的比较采用Mann-Whitney U检验。基因型频率和等位基因频率在病例组和对照组间的差异以χ2检验或者Fisher's确切概率法检验，并计算等位基因频率的OR值和95%CI。各组基因型的比较采用Global genotype检验。运用多元Logistic回归分析方法对影响ARDS患者APC浓度的混杂因素进行校正。所有的统计均采用Bonferroni法进行多重检验校正。多个SNPs之间的LD值用Haploview v4.1软件计算r2值，运用Haploview v4.1软件EM方法和PLINK软件omnibus法进行计算、比较单倍型分布。所有统计学分析均采用SPSS 17.0软件，双侧检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 入组患者的一般资料研究期间共入选ARDS患者275例，另外收集同期入住ICU、具有ARDS发病的高危因素但未进展至ARDS的337例重症患者作为疾病对照组。所有患者的一般资料见表 1。ARDS主要诱因包括：肺部感染、脓毒症、创伤、误吸等。ARDS组与非ARDS组相比，在性别、年龄、BMI、吸烟史、肝脏病史、糖尿病发病率等方面差异无统计学意义 (P>0.05)，但ARDS组患者APACHE Ⅱ评分和病死率均明显高于非ARDS组 (P < 0.01)。死亡组患者APACHE Ⅱ评分明显高于存活组 (P=0.007)，年龄和ARDS诱因等差异无统计学意义 (P>0.05)。
| 指标 | ARDS组 | 非ARDS组 | P1值 | ARDS存活组 | ARDS死亡组 | P2值 |
| 例数 | 275 | 337 | - | 124 | 151 | - |
| 年龄 | 63.6 ± 12.7 | 64.2 ± 14.2 | 0.57 | 62.4 ± 12.3 | 64.6 ± 14.1 | 0.07 |
| 男性 (例，%) | 165 (60) | 197 (59.8) | 0.69 | 76 (61.3) | 89 (58.9) | 0.69 |
| BMI (kg·m-2) | 23 ± 7 | 22 ± 7 | 0.23 | 22.8 ± 7.2 | 23.2 ± 6.9 | 0.16 |
| 糖尿病 (例，%) | 44 (16) | 46 (13.6) | 0.42 | 23 (18.5) | 21 (13.9) | 0.29 |
| 肝脏病史 | 13 (4.7) | 13 (3.9) | 0.59 | 8 (6.5) | 5 (3.3) | 0.22 |
| 吸烟史 | 123 (44.7) | 130 (38.6) | 0.12 | 62 (50) | 61 (40.4) | 0.11 |
| ARDS诱因 | ||||||
| 肺部感染 | 114 (41.5) | 164 (48.7) | 0.08 | 50 (40.3) | 64 (42.4) | 0.73 |
| 脓毒症 | 125 (45.5) | 130 (38.6) | 0.09 | 60 (48.4) | 65 (43.1) | 0.38 |
| 创伤 | 22 (8) | 22 (6.5) | 0.48 | 8 (6.5) | 14 (9.3) | 0.39 |
| 误吸 | 8 (2.9) | 14 (4.2) | 0.41 | 4 (3.2) | 4 (2.6) | 0.78 |
| 其他 | 6 (2.2) | 7 (2.1) | 0.93 | 2 (1.6) | 4 (2.6) | 0.56 |
| APACHE Ⅱ | 19.6 ± 3.2 | 15.6 ± 2.5 | < 0.01 | 18.7 ± 3.6 | 20.34 ± 4.5 | 0.007 |
| 病死率 (%) | 54.9 | 33.3 | < 0.01 | - | - | - |
| 注：P1 ARDS组VS非ARDS组；P2存活组VS死亡组 | ||||||
PC和EPCR基因SNPs的等位基因和基因型频率的分布见表 2。结果发现PC基因的2个SNPs：rs1799809和rs1158867高度连锁 (r2=0.93)，2个SNPs的等位基因频率在ARDS组和非ARDS组差异具有统计学意义。ARDS患者携带等位基因rs1799809 T和rs1158867 T的频率明显高于非ARDS组患者 (P=0.001 1, OR=1.569; P=0.001 6, OR=1.588)。rs1799809和rs1158867基因型分布在两组差异具有统计学意义 (P=0.007, P=0.009)。另外研究发现，由PC基因3个SNPs即rs1799809、rs1158867和rs2069912组成的单倍型与ARDS患者的易感性有关。单倍型CCC的分布频率在ARDS患者组 (10.8%) 明显低于非ARDS患者组 (16.9%)，差异具有统计学意义 (P=0.002)，单倍型CCC对ARDS发病具有保护作用 (表 3)。然而，EPCR基因2个SNPs即rs2069948和rs867186无论等位基因频率和基因型频率分布在两组中差异无统计学意义。
| SNP | 非ARDS组 | ARDS组 | P值 | OR (95%CI) |
| PC | ||||
| rs1799809 | 1.569 (1.192~2.066) | |||
| TT | 225 (67) | 213 (77.8) | ||
| TC | 95 (28.3) | 56 (20.4) | ||
| CC | 16 (4.8) | 5 (1.8) | 0.007a | |
| T | 545 (81.1) | 482 (87.9) | ||
| C | 127(18.9) | 66 (12.1) | 0.0011b | |
| rs1158867 | 1.588 (1.177~2.063) | |||
| TT | 226 (67.7) | 214 (78.4) | ||
| TC | 94 (28.1) | 54 (19.8) | ||
| CC | 14 (4.2) | 5 (1.8) | 0.009a | |
| T | 546 (81.7) | 482 (88.3) | ||
| C | 122 (18.3) | 64 (11.7) | 0.0016b | |
| rs2069912 | 1.082 (0.942~1.242) | |||
| TT | 106 (32.4) | 93 (35.1) | ||
| TC | 163 (49.8) | 135 (50.9) | ||
| CC | 58 (17.7) | 37 (14.0) | 0.439a | |
| T | 375 (57.3) | 321 (60.6) | ||
| C | 279 (42.7) | 209 (39.4) | 0.262b | |
| EPCR | ||||
| rs2069948 | 1.009 (0.862~1.181) | |||
| GG | 144 (43.3) | 128 (46.9) | ||
| GA | 149 (44.9) | 105 (38.5) | ||
| AA | 39 (11.7) | 40 (14.6) | 0.241a | |
| G | 437 (65.8) | 361 (66.1) | ||
| A | 227 (34.2) | 185 (33.9) | 0.912b | |
| rs867186 | 0.993 (0.670~1.469) | |||
| AA | 287 (85.9) | 234 (85.7) | ||
| AG | 43 (12.9) | 36 (13.2) | ||
| GG | 4 (1.2) | 3 (1.1) | 0.988a | |
| A | 617 (92.4) | 504 (92.3) | ||
| G | 51 (7.6) | 42 (7.7) | 0.970 b | |
| 注：a等位基因频率分布比较，b基因型频率分布比较；5个SNPs，Bonferroni校正的P值为0.01即P＜0.01为差异具有统计学意义 | ||||
| Haplotype | ARDS组 | 非ARDS组 | P1值 | 死亡组 | 存活组 | P2值 |
| TTT | 0.604 | 0.569 | 0.178 | 0.573 | 0.58 | 0.871 |
| TTC | 0.279 | 0.259 | 0.221 | 0.270 | 0.265 | 0.890 |
| CCC | 0.108 | 0.169 | 0.002 | 0.140 | 0.152 | 0.713 |
| 注：P1：ARDS组vs.非ARDS组；P2：存活组vs.死亡组；3种单倍型，Bonferroni校正的P值为0.0166，差异具有统计学意义 | ||||||
为进一步探讨PC和EPCR基因变异与ARDS患者预后的相关性，ARDS患者分为存活组和死亡组，比较PC和EPCR基因5个tagSNPs的等位基因、基因型和单倍型频率在两组中的分布差异。结果发现PC和EPCR基因的5个SNPs等位基因和基因型频率以及rs1799809、rs1158867和rs2069912组成的单倍型频率在存活组和死亡组之间差异无统计学意义 (P < 0.05) (见表 3和表 4)。PC和EPCR基因变异与ARDS患者的预后无明显的相关性。
| SNP | 存活组 | 死亡组 | P值 | OR (95%CI) |
| PC | ||||
| rs1799809 | 1.523 (0.945~2.455) | |||
| TT | 111 (73.5) | 102 (83) | ||
| TC | 37 (24.5) | 19 (15.4) | ||
| CC | 3 (2.0) | 2 (1.6) | 0.108a | |
| T | 259 (85.8) | 223 (90.7) | ||
| C | 43 (14.2) | 23 (9.3) | 0.08b | |
| rs1158867 | 1.565 (0.961~2.549) | |||
| TT | 111 (74.0) | 103 (83.7) | ||
| TC | 36 (24.0) | 18 (14.6) | ||
| CC | 3 (2.0) | 2 (1.6) | 0.145a | |
| T | 258 (86.0) | 224 (91.1) | ||
| C | 42 (14.0) | 22 (8.9) | 0.068b | |
| rs2069912 | 1.104 (0.891~1.368) | |||
| TT | 50 (34.0) | 43 (36.4) | ||
| TC | 73 (49.7) | 62 (52.5) | ||
| CC | 24 (16.3) | 13 (11.0) | 0.463a | |
| T | 173 (58.8) | 148 (62.7) | ||
| C | 121 (41.2) | 88 (37.3) | 0.365b | |
| EPCR | ||||
| rs2069948 | 0.979 (0.774~1.238) | |||
| GG | 68 (45.6) | 60 (48.4) | ||
| GA | 62 (41.6) | 43 (34.7) | ||
| AA | 19 (12.8) | 21 (16.9) | 0.414a | |
| G | 198 (66.4) | 163 (65.7) | ||
| A | 100 (33.6) | 85 (34.3) | 0.860b | |
| rs867186 | 1.093 (0.608~1.967) | |||
| AA | 128 (85.3) | 106 (86.2) | ||
| AG | 20 (13.3) | 16 (13.0) | ||
| GG | 2 (1.4) | 1 (0.8) | 0.915a | |
| A | 276 (92.0) | 228 (92.7) | ||
| G | 24 (8.0) | 18 (7.3) | 0.766b | |
| 注：a等位基因频率分布比较; b基因型频率分布比较 | ||||
rs1799809位于PC基因的启动子区域，影响PC基因的表达。研究收集51例ARDS患者入院24 h内的血浆，TT、TC和CC基因型的患者分别为37例、12例和2例。结果发现携带基因型TT的患者血浆中APC的浓度明显低于基因型TC和CC的患者[(4.47 ± 0.99)μg/L vs.(5.83 ± 1.45)μg/L，P=0.006) (见图 1)，Logistic回归分析去除年龄、APACHE Ⅱ评分等混杂因素后，差异具有统计学意义 (Padj=0.02)。
|
| 图 1 rs1799809不同基因型ARDS患者血浆APC浓度 Figure 1 The concentration of APC in different rs1799809 genotype patients |
|
|
本研究发现凝血/纤溶通路关键基因-PC的SNPs和单倍型与中国汉族人群ARDS的易感性显著相关。即存在高危因素的情况下，携带rs1799809等位基因T个体更易患ARDS；同时研究也发现携带不同基因型的ARDS患者在发病初期血浆APC的浓度不同，携带基因型TT的患者血浆APC的浓度显著降低，这可能与基因遗传结构存在一定的相关性。过度和持续激活的炎症反应是ARDS发病的始动因素，此外凝血系统的激活和纤溶系统的失调促进了ARDS的发病和肺间质纤维化的形成；并且炎症和凝血系统相互促进，相互增强，导致病情进一步加重、微血栓形成，甚至多器官功能衰竭的发生。有研究发现，ARDS患者血浆中APC的水平降低，纤溶酶原激活物抑制因子1 (PAI-1) 增加，APC和PAI的浓度与患者的预后相关[3, 8]。
目前国内外有关ARDS发病遗传易感性的研究主要集中在编码炎症介质的基因，凝血/纤溶通路的相关基因研究较少[1]。PC基因位于染色体2q13-14区域，近年来有研究发现位于启动子区域的2个SNPs即rs1799809和rs1799808以及它们组成的单倍型与血栓性疾病、脓毒症等疾病易感性有关[9-11]。Chen等[12]研究发现PC基因单倍型rs1799809T/rs1799808C与严重脓毒症的病情程度和预后显著相关，携带单倍型rs1799809T/rs1799808C的患者SOFA评分和病死率更高。随后，Russell等[13]研究证实与单倍型rs1799809T/rs1799808C高度连锁的rs2069912C与东亚人群严重脓毒症的病情程度、器官功能衰竭和不良预后相关。本研究发现携带rs1799809 T个体ARDS发病率更高，而且PC基因3个SNPs (其中包括rs1799809和rs2069912) 组成的单倍型也与ARDS的发病有关。因此，本研究也进一步证实了PC基因遗传变异与急性炎症反应相关的疾病 (如：脓毒症和ARDS) 等易感性和病情程度相关。rs1799809和rs1799808位于PC基因的启动子区域，影响PC基因的表达。Aiach等[9]研究发现rs1799809和rs1799808组成的单倍型与健康个体外周血PC的浓度相关，本研究也发现rs1799809基因型与ARDS患者血浆APC的浓度有关，携带等位基因型TT的患者血浆APC的浓度显著降低。APC浓度的降低导致了体内天然抗活性物质的减少，从而影响ARDS的发病。尽管有研究发现EPCR基因与高加索人ARDS患病易感性有关[14]，但本研究未发现其与汉族人群的ARDS遗传易感性相关，可能是种群的遗传结构不同[15]。尽管本研究发现PC基因变异与汉族人群ARDS的易感性有关，但该研究为单中心的病例对照研究，入组患者相对偏少，尚需要进一步扩大样本量进行验证。另外，仅选择ICU具有ARDS发病高危因素的患者作为疾病对照组，没有设立健康对照组，存在一定的局限性。将来可以开展多中心前瞻性研究、扩大样本量、同时设立相匹配的健康对照组进一步对结果进行验证。
| [1] | 宋振举, 白春学. 急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征分子标志物:从单一到联合[J]. 中华急诊医学杂志, 2014, 23(3): 245-247. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.03.001 |
| [2] | Toussaint S, Gerlach H. Activated protein C for sepsis[J]. N Engl J Med, 2009, 361(27): 2646-2652. DOI:10.1056/NEJMct0808063 |
| [3] | Koyama K, Madoiwa S, Nunomiya S, et al. Combination of thrombin-antithrombin complex, plasminogen activator inhibitor-1, and protein C activity for early identification of severe coagulopathy in initial phase of sepsis: a prospective observational study[J]. Crit Care, 2014, 18(1): R13. DOI:10.1186/cc13190 |
| [4] | 宋振举, 童朝阳, 白春学. 急性肺损伤的分子遗传学研究进展[J]. 中华急诊医学杂志, 2012, 21(3): 334-336. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.03.031 |
| [5] | Yin J, Yao CL, Liu CL, et al. Association of genetic variants in the IRAK-4 gene with susceptibility to severe sepsis[J]. World J Emerg Med, 2012, 3(2): 123-127. DOI:10.5847/wjem.j.1920-8642.2012.02.008 |
| [6] | Xue M, Sun Z, Shao M, et al. Diagnostic and prognostic utility of tissue factor for severe sepsis and sepsis-induced acute lung injury[J]. J Transl Med, 2015, 13: 172. DOI:10.1186/s12967-015-0518-9 |
| [7] | Bernard GR, Artigas A, Brigham KL, et al. The American-European Consensus Conference on ARDS. Definitions, mechanisms, relevant outcomes, and clinical trial coordination[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1994, 149(3/1): 818-824. |
| [8] | Kinasewitz GT, Yan SB, Basson B, et al. Universal changes in biomarkers of coagulation and inflammation occur in patients with severe sepsis, regardless of causative micro-organism[J]. Crit Care, 2004, 8(2): R82-90. DOI:10.1186/cc2459 |
| [9] | Aiach M, Nicaud V, Alhenc-Gelas M, et al. Complex association of protein C gene promoter polymorphism with circulating protein C levels and thrombotic risk[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1999, 19(6): 1573-1576. DOI:10.1161/01.ATV.19.6.1573 |
| [10] | Zhu C, Jiang T, Miao Y, et al. The SNPs (-1654C/T, -1641A/G and-1476A/T) of protein C promoter are associated with susceptibility to pulmonary thromboembolism in a Chinese population[J]. J Thorac Dis, 2014, 6(7): 943-948. DOI:10.3978/j.issn.2072-1439.2014.06.30 |
| [11] | Binder A, Endler G, RiegerS, et al. Protein C promoter polymorphisms associate with sepsis in children with systemic meningococcemia[J]. Hum Genet, 2007, 122(2): 183-190. DOI:10.1007/s00439-007-0392-5 |
| [12] | Chen QX, Wu SJ, Wang HH, et al. Protein C-1641A/-1654C haplotype is associated with organ dysfunction and the fatal outcome of severe sepsis in Chinese Han population[J]. Hum Genet, 2008, 123(3): 281-287. DOI:10.1007/s00439-008-0476-x |
| [13] | Russell JA, Wellman H, Walley KR. Protein C rs2069912 C allele is associated with increased mortality from severe sepsis in North Americans of East Asian ancestry[J]. Hum Genet, 2008, 123(6): 661-663. DOI:10.1007/s00439-008-0509-5 |
| [14] | Sapru A, Liu KD, Wiemels J, et al. Association of common genetic variation in the protein C pathway genes with clinical outcomes in acute respiratory distress syndrome[J]. Crit Care, 2016, 20(1): 151. DOI:10.1186/s13054-016-1330-5 |
| [15] | Hansson HH, Turner L, Mller L, et al. Haplotypes of the endothelial protein C receptor (EPCR) gene are not associated with severe malaria in Tanzania[J]. Malar J, 2015, 14: 474. DOI:10.1186/s12936-015-1007-6 |