中华急诊医学杂志  2017, Vol. 26 Issue (6): 614-621
儿童医院重症监护病房金黄色葡萄球菌分子特征的研究
刘颖超, 杨鑫, 王丽娟, 宋文琪, 董方, 姚开虎, 钱素云     
100045 北京,首都医科大学附属北京儿童医院重症医学科 (刘颖超、杨鑫、王丽娟、钱素云),检验科 (宋文琪、董方);100045 北京,首都医科大学附属北京儿童医院、北京市儿科研究所、儿科学国家重点学科、教育部儿科重大疾病研究重点实验室,国家呼吸系统疾病临床医学研究中心,儿童呼吸道感染性疾病研究北京市重点实验室 (姚开虎)
摘要: 目的 了解儿童医院重症监护病房 (intensive care unit,ICU) 金黄色葡萄球菌 (简称金葡菌) 的分子学分型、毒力基因携带及耐药情况。 方法 收集鉴定2016年1月至2016年12月北京儿童医院新生儿及儿童ICU患儿临床送检标本中培养出的金葡菌,采用头孢西丁纸片法和mecA检测鉴定耐甲氧西林金葡菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA) 或甲氧西林敏感金葡菌 (methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA);对所有菌株进行多位点序列分型 (multilocus sequence typing,MLST) 和spa分型,并对MRSA菌株进行葡萄球菌盒氏染色体 (staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec) 分型;采用PCR方法检测21种超抗原基因和杀白细胞素 (Panton-Valentine leukocidin,pvl) 基因;采用E-test方法检测12种抗生素药物敏感性。使用Fisher’s确切概率法比较MRSA与MSSA菌株在毒力因子携带及耐药方面的差异。 结果 共收集金葡菌39株 (其中MRSA菌株18株),分别来源于肺炎 (包括重症肺炎)、败血症和皮肤软组织感染;ST59-SCCmecⅣa-t437(55.6%) 和ST398-t571(28.6%) 分别是MRSA和MSSA分离株最常见的流行克隆。26株 (66.7%) 金葡菌菌株至少携带一种超抗原基因,最常见的分别是seb (38.5%)、sek (30.8%) 和seq (20.5%),最常见的超抗原基因型为seb-sek-seq,占18.0%。在本研究中,pvl基因阳性率为25.6%,MRSA和MSSA分离株pvl基因携带率的差异无统计学意义 (P < 0.05)。所有菌株的多重耐药率为79.9%,红霉素耐药率为100%,其次为青霉素、克林霉素和氯霉素,耐药率分别为94.9%、53.8%和51.3%,均对复方新诺明、利福平、万古霉素和利奈唑胺敏感。 结论 儿童医院ICU金葡菌分离株主要来源于肺炎、败血症和皮肤软组织感染,MRSA和MSSA分离株最常见的流行克隆分别是ST59-SCCmecⅣa-t437和ST398-t571。金葡菌分离株的超抗原基因携带率和多重耐药率较高。
关键词: 金黄色葡萄球菌     耐甲氧西林金黄色葡萄球菌     儿童     重症监护病房     分子分型     毒力     药物敏感性     多重耐药    
Molecular characteristics of Staphylococcus aureus isolated from intensive care units of children's hospital
Liu Yingchao, Yang Xin, Wang Lijuan, Song Wenqi, Dong Fang, Yao Kaihu, Qian Suyun     
Pediatric Intensive Care Unit, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045, China (Liu YC, Yang X, Wang LJ, Qian SY); Department of Examination, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045, China (Song WQ, Dong F); Key Laboratory of Major Diseases in Children and National Key Discipline of Pediatrics (Capital Medical University), Ministry of Education, Beijing Pediatrics Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045, China (Yao KH)
Corresponding author: Qian Suyun, Email:syqian1211@163.com
Abstract: Objective To study the molecular characteristics of the Staphylococcus aureus isolated from the intensive care units (ICUs) of children's hospital. Methods From January 2016 to December 2016, atotal of 39 S. aureus strains were collected and identified from various clinical specimens that were obtained from patients who were confined in the neonatal and pediatric ICUs of Beijing Children's Hospital. Methicillin-resistant S. aureus (MRSA) and methicillin-susceptible S. aureus (MSSA) were identified using the cefoxitin disc method and the detection of the mecA gene. Multilocus sequence typing (MLST) and spa typing were analyzed using the PCR, and the staphylococcal chromosomal cassette mec (SCCmec) type was analyzed for the MRSA isolates. Twenty-one superantigen genes and the Panton-Valentine leukocidin (pvl) gene were also detected by PCR. Their susceptibility to 12 antibiotics was evaluated using the E-test method. The differences in prevalence of virulence genes and antimicrobial resistance were compared between the MRSA and MSSA isolates by Fisher's exact test. Results All the S. aureus strains were isolated from secretion inside the airway of pneumonia (including severe pneumonia), the blood of patients with bacteremia, and exudate of skin and soft tissue infections. ST59-SCCmecⅣa-t437 (55.6%) and ST398-t571 (28.6%) were the most predominant clones of MRSA and MSSA, respectively. Of the 39 isolates, 26 strains (66.7%) had at least one superantigen gene, and seb (38.5%), sek (30.8%), and seq (20.5%) were the most common genes; seb-sek-seq (18.0%) was the main virulence genotype. The pvl gene's positive rate was 25.6%, and no significant difference between MRSA and MSSA was observed (P>0.05). Notably, 79.9% of the S. aureus isolates were multidrug resistant, and 94.9%, 53.8%, and 51.3% of the isolates were resistant to erythromycin, clindamycin, and chloramphenicol, respectively. The tested isolates were susceptible to trimethoprim/sulfamethoxazole, rifampicin, and vancomycin. Conclusions The S. aureus strains from the ICUs of children's hospital were isolated from the secretion inside the airway of pneumonia (including severe pneumonia), the blood of patients with bacteremia, and exudate of skin and soft tissue infections. ST59-SCCmecⅣa-t437 (55.6%) and ST398-t571 (28.6%) were the common clones of MRSA and MSSA, respectively. The prevalence of superantigen genes and the multidrug resistant rate were relatively high.
Key words: Staphylococcus aureus     Methicillin-resistant Staphylococcus aureus     Pediatric     Intensive care unit     Molecular characteristics     Virulence     Antimicrobial susceptibility     Multidrug resistance    

金黄色葡萄球菌 (staphylococcus aureus,S.aureus,简称金葡萄) 是一种重要的人类病原菌,它可以引起多种疾病,从皮肤软组织感染到脓毒症、坏死性肺炎、骨髓炎等致死性疾病[1]。20世纪60年代,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA) 的出现,更是给临床治疗金葡菌感染带来了极大的挑战。金葡菌致病力强、耐药率高,是儿童医院重症监护病房 (intensive care unit,ICU) 中最常见的革兰阳性致病菌,且呈逐年上升的趋势[2]。为了解儿童医院ICU金葡菌分离株的分子特征,本研究对2016年度北京儿童医院新生儿和儿童ICU分离的金葡菌分离株进行了分子学分型、毒力基因分布和抗生素耐药性分析,以期为防治ICU金葡菌感染提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 菌株的来源和鉴定

所用菌株为2016年1月至2016年12月从首都医科大学附属北京儿童医院新生儿和儿童ICU临床送检标本中培养分离的金葡菌共39株。标本来源为呼吸道、脓液、伤口、血液、穿刺液和分泌物。同一病例检测出的相同菌株作为1株。对各类临床标本进行培养,通过菌落形态学鉴定出金葡菌,然后通过凝固酶试验和PCR方法检测nuc基因进一步再确认。按照2013年美国临床实验室标准化研究所推荐的头孢西丁纸片 (英国Oxoid公司) 法及使用PCR方法检测mecA基因进行MRSA菌株的筛选。以金葡菌标准株ATCC25923作为对照质控菌株。

1.2 方法 1.2.1 DNA提取

溶葡萄球菌素 (加拿大BBI公司),1 200 U/mg;硅胶模型TM基因组DNA提取试剂盒 (北京赛百盛公司),严格按照试剂盒说明书操作。所提DNA作为所有PCR的模板。

1.2.2 多位点序列 (multilocus sequence typing,MLST) 分型

使用PCR扩增金葡菌的7个管家基因:arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqil。扩增引物参考Enright等[3]的设计。扩增出来的目的片段由北京天一辉远生物技术有限责任公司进行测序。测序结果在MLST数据网站 (http://www.mlst.net/) 上比对等位基因的序列型,从而判定本株菌的ST类型。

1.2.3 葡萄球菌盒氏染色体 (staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec) 及其亚型分型

采用Milheirico等[4-5]提出的多重PCR的方法对所有的分离株进行SCCmec分型及亚型的检测。PCR产物在含溴乙锭的1.5%的琼脂凝胶中电泳,用凝胶成像仪观察和保存扩增结果。SCCmec分型的标准菌株由日本顺天堂大学Teruyo Ito教授馈赠。

1.2.4 spa分型

spa分型的PCR扩增引物:上游引物spaF:5’-GACGATCCTTCAGTGAGCAAAG-3’;下游引物spaR:5’-GCAGCAATTTTGTCAGCAGTAG-3’。扩增的目的片段由北京天一辉远生物技术有限责任公司进行测序,测序结果通过spa分型数据库 (http://spaserver.ridom.de/) 进行分型。

1.2.5 毒力基因检测

按照Holtfreter等[6]的试验方法依次进行5组多重PCR反应。检测的基因为19种肠毒素基因和两种剥脱毒素基因:(1) sea、seh、sec和tsst-1;(2) sed、etd、eta和sek;(3) see、seb、sem、sel和seo;(4) sen、seg、seq和sej;(5) sei、ser、seu和sep。参照Lina等[7]提供的方法检测杀白细胞素 (Panton-Valentine leukocidin,pvl) 基因。PCR产物在含溴乙锭的1.5%的琼脂凝胶中电泳,用凝胶成像仪观察和保存扩增结果。

1.2.6 药物敏感性实验

根据2013年美国临床实验室标准化研究所制定的标准,采用E-test法 (法国梅里埃公司) 检测所有菌株对青霉素 (PEN)、头孢呋辛 (CXM)、红霉素 (ERY)、克林霉素 (CLI)、庆大霉素 (GEN)、复方新诺明 (SXT)、环丙沙星 (CIP)、氯霉素 (CHL)、四环素 (TCY)、利福平 (RIF)、万古霉素 (VAN)、利奈唑胺 (LNZ) 这12种抗生素的药物敏感性,以金葡菌ATCC29213作为对照质控菌株,记录所测菌的最低抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration,MIC),并计算MIC50。同时对3类或3类以上抗生素耐药的金黄色葡萄球菌菌株定义为多重耐药[8]

1.3 统计学方法

使用SPSS 19.0软件进行统计分析。正态分布且方差齐的计量资料用均数±标准差 (x±s) 表示,组间比较采用成组t检验;非正态分布、方差不齐的计量资料用中位数[M (P25P75]表示,组间比较采用秩和检验;计数资料用例数或菌株数表示,因总样本量小于40,故用Fisher’ s确切概率法。P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 一般资料

本研究共收集39株金葡菌感染分离株,其中男性患儿28例,女性患儿11例;有18例来自城市,21例来自农村;中位年龄是4个月 (3 d~8岁);入住ICU天数中位数为13 d (1 d,57 d),总住院天数中位数为17 d (1 d,60 d)。从病种来源看,肺炎以27例居首位 (69.2%),其中重症肺炎占48.1%,共13例,其次为败血症,7例 (17.9%),最后为皮肤软组织感染,5例 (12.8%),包括结膜炎2例,鼻部蜂窝织炎1例,脐炎1例,右臂蜂窝织炎1例。从治疗转归方面看,好转出院24例,自动出院8例,转院6例,死亡1例。39株金葡菌分离株中,18株为MRSA,21株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 (methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA),MRSA和MSSA分离株在患儿性别、居住地、总住院天数、入住ICU天数及病种方面的差异无统计学意义 (P>0.05)。

2.2 分子分型

在18株MRSA分离株中,共检测出5种ST型,最主要的是ST59(13/18,72.2%),其次为ST22(2/18,11.1%),ST121、ST338、ST1224均各1株 (分别占5.6%)。SCCmec分型共检测出2种型别,分别为Ⅳa型 (14/18,77.8%) 和Ⅴ型 (4/18,22.2%)。spa分型则以t437为主 (12/18),占66.7%,其次为t309(2/18,11.1%),t441、t3485、t1765各1株 (分别占5.6%),此外还有1株spa无法分型 (表 1)。综上所述,在本研究中MRSA的流行克隆是ST59-MRSA-SCCmecⅣa-t437,共10株,所占比例为55.6%。

表 1 18株MRSA分离株分子学分型及超抗原基因型、耐药表型分布 Table 1 Distribution of molecular characterization, superantigen genotypes and drug-resistant phenotypes in 18 MRSA isolates
MLST分型 SCCmec分型 spa分型 pvl+ 超抗原基因型 耐药表型
ST59(13) Ⅳa (13) t437(10) 2 seb-sek-seq (5), seb-sek (3), NTa(2) CLI-PEN-ERY (4), CLI-CXM-CHL-PEN-ERY (3),
CLI-CHL-PEN-ERY (2), CLI-CXM-PEN-ERY (1)
t441(1) 0 seb-sek-seq (1) CLI-CHL-PEN-ERY (1)
t3485(1) 0 seb-sek (1) CLI-PEN-ERY-TCY (1)
t1765(1) 0 NTa(1) CLI-CHL-PEN-ERY (1)
ST22(2) Ⅴ(2) t309(2) 2 sei (1), sei-sem-seo (1) PEN-ERY (2)
ST121(1) Ⅴ(1) NT (1) 0 sei-sem-seu-eta (1) GEN-CLI-CHL-PEN-ERY (1)
ST338(1) Ⅴ(1) t437(1) 1 sec-sel-tsst-1(1) PEN-ERY-TCY (1)
ST1224(1) Ⅳa (1) t437(1) 0 seb-sek-seq (1) CLI-CHL-PEN-ERY (1)
注:aNT为未检测出

在21株MSSA分离株中则表现出更多样化的遗传背景。共检测出10种ST型,以ST398为主 (6/21,28.6%),其次分别为ST22(3/21,14.3%),ST59、ST15、ST6、ST5各2株 (9.5%),ST188、ST88、ST25、ST1各1株 (4.8%)。spa分型共有11种,其中6株属于t571型 (28.6%),3株属于t309(14.3%),各有2株属于t084、t701(9.5%),而t163、t437、t002、t1818、t189、t660、t127各1株 (4.8%),此外还有1株spa无法分型 (表 2)。综合上述基因分型,在本研究中MSSA的流行克隆是ST398-MSSA-t571,共6株,所占比例为28.6%。ST59-t437型,ST22-t309型在MRSA与MSSA分离株中均存在。

表 2 21株MSSA分离株分子学分型及超抗原基因型、耐药表型分布 Table 2 Distribution of molecular characterization, superantigen genotypes and drug-resistant phenotypes in 21 MSSA isolates
MLST分型 spa分型 pvl+ 超抗原基因型 耐药表型
ST398(6) t571(6) 0 NTa(6) CHL-PEN-ERY (1), GEN-CLI-CHL-PEN-ERY (2), PEN-CIP-ERY (1), ERY (2)
ST22(3) t309(3) 3 sem-seo (1), sei-sem-seo (1), NTa(1) CHL-PEN-ERY (2), PEN-ERY-TCY (1)
ST59(2) t163(1) 0 seb (1) GEN-CLI-PEN-ERY (1)
t437(1) 1 NTa(1) CLI-CHL-PEN-ERY-TCY (1)
ST15(2) t084(2) 0 NTa(2) CHL-PEN-CIP-ERY (1), CLI-PEN-ERY-TCY (1)
ST6(2) t701(2) 0 sea (1), seb (1) CHL-PEN-ERY (1), PEN-ERY (1)
ST5(2) t002(1) 0 sec-sed-sei-sej-sel-sem-seo-ser (1) GEN-CLI-CHL-PEN-ERY (1)
t1818(1) 0 sec-sed-sei-sel-sem-seo-ser (1) GEN-CLI-CHL-PEN-CIP-ERY (1)
ST188(1) t189(1) 0 seb (1) PEN-ERY (1)
ST88(1) NTa (1) 1 sep (1) PEN-ERY (1)
ST25(1) t660(1) 0 seb-seg-sei-sem-seo-etd (1) PEN-ERY (1)
ST1(1) t127(1) 0 sea-seh-sek-seq (1) PEN-ERY (1)
2.3 超抗原毒力基因及pvl基因携带情况

在检测的21种超抗原基因中,26株 (66.7%) 至少携带一种超抗原基因,MRSA和MSSA分离株超抗原基因的整体携带率分别为83.3%(15/18) 和52.3%(11/21),两者差异无统计学意义 (P>0.05)。本研究中,最常见的是seb (15/39,38.5%)、sek (12/39,30.8%)、seq (8/39,20.5%),最常见的超抗原基因型为seb-sek-seq,占18.0%(7/39)。所所有菌株均未发现携带see、sen基因。MRSA分离株的seb、sek、seq基因携带率明显高于MSSA分离株 (P值<0.05)(表 3)。

表 3 39株金葡菌分离株超抗原基因携带情况 (株,%) Table 3 Detection of superantigen genes of 39 S.aureus isolates (strain, %)
组别 sea seb sec sed see seq seh sei sej sek sel sem sen seo sep seq ser seu eta etd tsst-1 pvl
MRSA
(n=18)
0 11(61.1) 1(5.6) 0 0 0 0 3(16.7) 0 11(61.1) 1(5.6) 2(11.1) 0 2(11.1) 0 7(62.7) 0 1(5.6) 1(5.6) 0 1(5.6) 5(27.8)
MSSA
(n=21)
3(14.3) 4(19.0) 2(9.5) 2(9.5) 0 1(4.8) 1(4.8) 4(19.0) 1(4.8) 1(4.8) 2(9.5) 5(23.8) 0 5(23.8) 1(4.8) 1(4.8) 2(9.5) 0 0 1(4.8) 0 5(23.8)
合计
(n=39)
3(7.7) 15(38.5) 3(7.7) 2(5.1) 0 1(2.6) 1(2.6) 7(17.9) 1(2.6) 12(30.8) 3(7.7) 7(17.9) 0 7(17.9) 1(2.6) 8(20.5) 2(5.1) 1(2.6) 1(2.6) 1(2.6) 1(2.6) 10(25.6)
Pa 0.234 0.010 1.000 0.489 - 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000 1.000 0.417 - 0.417 1.000 0.014 0.489 0.461 0.461 1.000 0.461 1.000
注:a MRSA与MSSA比较

不同ST分型分离株超抗原基因谱各有特点 (表 12)。15株ST59型金葡菌分离株中有10株 (66.7%) 为seb-sek-seq和seb-sek型,占这两种型别的91.0%(10/11)。ST188、ST6和ST88型分离株仅携带1种超抗原基因。而ST5、ST25型分离株则携带同时携带6种及以上超抗原基因,且均包含sei-sem-seo基因。ST398和ST15型分离株未发现任何毒力基因。

在本研究中共检测到10株pvl阳性金葡菌分离株 (10/39,25.6%)(表 3),其中5株均属于ST22-t309型 (5/10,50%),3株属于ST59-t437(3/10,33.3%),1株属于ST88-NT (1/10,10%),1株属于ST338-t437(1/10,10%)(表 12)。MRSA和MSSA分离株的pvl携带率的差异无统计学意义 (27.8% vs. 23.8%,P < 0.05)。

2.4 药物敏感性比较

所有菌株均对复方新诺明、利福平、万古霉素和利奈唑胺敏感。红霉素耐药率为100%,其次为青霉素、克林霉素和氯霉素,耐药率分别为94.9%、53.8%、51.3%。MRSA对头孢呋辛和克林霉素的耐药率高于MSSA,且差异具有统计学意义 (P < 0.05)。所有菌株的多重耐药率为79.9%(30/39),MRSA与MSSA的多重耐药率分别为88.9%、66.7%,两者差异无统计学意义 (P < 0.05)(见表 4)。MRSA菌株最常见的耐药表型是CLI-CHL-PEN-ERY (5/18,27.8%),MSSA最常见的耐药表型是PEN-ERY (5/21,23.8%)(见表 12)。

表 4 39株金葡菌分离株药物敏感性结果 Table 4 Results of the antimicrobial susceptibility of 39 S.aureus isolates
抗生素 耐药率
(%)
MRSA (n=18) MSSA (n=21) Pa
MIC范围
(mg/L)
MIC50
(mg/L)
耐药株数 耐药率
(%)
MIC范围
(mg/L)
MIC50
(mg/L)
耐药株数 耐药率
(%)
青霉素 94.9 0.75~64 12 18 100 0.023~64 1 19 90.5 0.489
头孢呋辛 10.3 1.5 ~512 4 4 22.2 0.5~2 0.75 0 0 0.037
红霉素 100 0.75 ~ 512 >256 18 100 1.5~512 >256 21 100 -
克林霉素 53.8 0.25 ~ 512 >256 15 83.3 0.19~512 0.38 6 28.6 0.001
庆大霉素 15.4 0.75 ~ 48 1.5 1 5.6 1~128 1.5 5 23.8 0.189
复方新诺明 0 0.023 ~0.064 0.047 0 0 0.016~1.5 0.047 0 0 -
环丙沙星 10.3 0.38 ~2.00 0.5 1 5.6 0.38~3 0.5 3 14.3 0.609
氯霉素 51.3 6~24 8 9 50.0 4~256 12 11 52.4 0.340
四环素 17.9 0.094~12 0.19 4 22.2 0.125~32 0.25 3 14.3 0.682
利福平 0 0.004~0.008 0.006 0 0 0.006~0.012 0.006 0 0 -
万古霉素 0 0.5~1.5 0.75 0 0 0.5~1.5 0.75 0 0 -
利奈唑胺 0 2~4 2 0 0 2~4 2 0 0 -
多重耐药 79.9 - - 16 88.9 - - 14 66.7 0.138
注:a MRSA与MSSA比较
3 讨论

重症监护病房的患者具有住院时间长、外科干预多、侵入性操作多的特点[9],再加上儿童的免疫系统相对发育不成熟,均是导致ICU患儿发生感染的高危因素。而金葡菌是ICU,特别是儿童医院ICU常见的病原菌之一,占革兰阳性球菌的19.3%,其次为大肠杆菌和表皮葡萄球菌[2, 10-11]。分子生物学分型对监测菌株遗传背景、同源性,确定爆发流行菌株的基因型及扩散趋势具有十分重要的意义。在世界不同地区的重症监护病房,MRSA的流行克隆不同,在欧洲以ST8和ST22为主[12],在美国以ST5(USA100) 和ST8(USA300) 为主[13],我国台湾地区以ST59为主[14],而在我国成人重症监护病房MRSA分离株则以ST239为主[15-16]。在本研究中,儿童医院重症监护病房MRSA分离株最常见的ST型为ST59,这与2012年本课题组的报道相一致[17]

与MRSA相比,MSSA感染分离株通常表现出更多样化的基因背景,在本研究中共发现10种ST分型,最主要的是ST398-MSSA-t571(占28.6%),这一结果与王辉等人的报道相一致,但与我国南方及世界其他地区,如巴西、荷兰、中国台湾地区等地不同[18-21]。值得注意的是,ST398型是21世纪初在MRSA菌株中发现的一类特殊ST型别,它与牲畜和从事与牲畜相关工作的人群有关[22],可造成人类皮肤软组织感染、感染性心内膜炎、骨髓炎等。2012年对我国七城市儿童MRSA感染分离株的研究中曾发现2株ST398-MRSA-t034菌株,且该患儿均来自农村[17]。在本研究中儿童医院ICU的MSSA菌株以ST398型为流行克隆,除一例患儿来自农村外,其余均来自城市。近期有研究显示MSSA ST398型菌株的来源更加多样化,除猪、牛等牲畜外,在从事牛乳、牛肉、烧烤等相关制品的人群中也发现了该型别,且ST398克隆的MSSA菌株对四环素、大环内酯类/林可酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、环丙沙星、壮观霉素、奎奴普汀/达福普汀的耐药率较非ST398克隆菌株更高[23],因此该克隆的出现应当引起重视并密切观察。既往通常认为MRSA的出现是由于MSSA获得了SCCmec从而形成了MRSA[24],因此这可能揭示了MSSA ST398克隆作为MRSA ST398克隆出现的“储蓄池”的作用。

SCCmec是MRSA特征性分子结构,根据mec复合体和ccr复合体的不同,可将SCCmec分为Ⅰ~Ⅺ型,根据J区不同,又可分为许多亚型[25]。既往SCCmec分型被认为是区分医院获得性 (hospital-associated,HA-) 和社区获得性 (community-associated,CA-) MRSA的一项重要分子标志。有研究证实,在我国儿童CA-MRSA菌株的流行克隆是ST59-SCCmecⅣ/Ⅴ和ST338-SCCmecⅣ/Ⅴ(ST59和ST338仅有一个位点变异)[26],而HA-MRSA菌株的主要流行克隆是ST239-SCCmecⅢ[27]。在本研究中,儿童医院ICU MRSA分离株的流行克隆是ST59-MRSA-SCCmecⅣa,这与之前的报道相一致,这说明本研究中的MRSA菌株可能属于社区获得性。但近期一些研究在HA-MRSA菌株中发现了Ⅳ型SCCmec,而Ⅲ型SCCmec在HA-MRSA和CA-MRSA中均被发现[28-29],说明这两种SCCmec型别可能在社区和院内相互传播。因此HA-和CA-MRSA之间的界限越来越模糊了。应该通过临床特征,而不是分型来定义MRSA菌株。

有研究在中国台湾地区发现ST59-Ⅳ和ST59-Ⅴ克隆可导致院内获得性感染,并且该克隆占院内血流感染的25%[30];在韩国,24%的院内相关菌血症主要由CA-MRSA相关ST72-SCCmecⅣ克隆造成的[31];在我国大陆,在社区最常见的克隆型ST59-SCCmecⅣ/Ⅴ,可导致儿童院内感染,且患儿年龄更小、侵入性感染更多见[27]。在本研究中,儿童重症监护病房MRSA感染分离株的流行克隆是ST59-MRSA-SCCmecⅣa,而未发现HA-MRSA菌株的代表ST239-SCCmecⅢ菌株。HA-MRSA菌株的逐渐减少,这可能是由于CA-MRSA携带基因片段短的Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型SCCmec,与HA-MRSA相比更易适应外界环境,生长率更高且更易于在人体内繁殖;同时CA-MRSA菌株比HA-MRSA具有更强的毒力和菌落蔓延能力,致病性、侵袭性更强[32]。因此,加强对金葡菌感染分离株基因型的监测,有助于对菌株致病力、耐药性变化的了解。

金葡菌通过释放多种细胞外毒素,如超抗原毒素、PVL等而表现出较强的致病性。PVL是属于双组份毒素家族的一种金黄色葡萄球菌特有的外毒素,由lukF-PV、lukS-PV基因编码,通过在细胞膜上产生孔来杀伤白细胞,是导致坏死性肺炎、皮肤软组织感染的重要毒素[33]。以往曾认为PVL是CA-MRSA特征性的分子标志,在我国儿童CA-MRSA分离株中pvl基因携带率达58.6%[26],在本研究中,儿童重症监护室MRSA分离株的pvl基因携带率较低,占27.8%。近期不断有研究证实pvl基因也存在于MSSA中,如在我国重庆,MSSA菌株的pvl基因携带率为27.4%,与本研究相似[34]

超抗原毒素的基因位于可移动基因元件上,如致病岛、噬菌体和质粒上,其编码的超抗原毒素包括肠毒素 (enterotoxin)、中毒性休克综合征毒素 (toxic shock syndrome toxin,TSST)、剥脱性毒素 (exfoliative toxin),能够显著改变宿主的免疫功能,诱发高热、增强宿主对毒素杀伤效应的敏感性,并诱导T淋巴细胞增殖[35]。超抗原毒素基因在不同地理来源的菌株中呈现多样性分布。在韩国的金葡菌分离株中,有50.8%的菌株携带至少一种超抗原基因,最常见的是tsst-1,其次是seb、sea、sed、see、sec[36];在美国,有超过99%的伤口和血液分离的金葡菌分离株携带至少一种超抗原基因,最常见的是ser,其次是sep、sek、sem、sei[37];在我国,儿童金葡菌菌株中有88.9%携带毒力基因,最常见的依次为sek、seq和seb[38]。在本研究中,儿童医院ICU金葡菌分离株超抗原基因携带率稍低,占66.7%,最主要的毒力基因与之前的报道一致。超抗原基因谱在不同ST分型金葡菌中亦各具特点。ST59型菌株最常见的基因谱为seb-sek-seq;在日本和中国台湾地区则以seb为主[39-40]。此外,ST5和ST25菌株携带同时携带7种及以上超抗原基因,且均包含sei-sem-seo基因。sei-sem-seo是肠毒素基因簇一部分,它包括seg-sei-sem-sen-seo,被认为可能在菌株致病中发挥重要作用,该克隆菌株均来自肺炎及败血症患者,因此以上两种克隆需引起重视。

ICU是医院中抗生素使用率最高和抗生素耐药情况最严重的地方。自从世界上第一例耐万古霉素的金黄色葡萄球菌出现,更是给金葡菌感染的治疗造成了新的挑战。在本研究中,儿童医院ICU金葡菌菌株的多重耐药率达79.9%,且所有菌株均对红霉素耐药,对青霉素耐药率为94.9%,对克林霉素和氯霉素的耐药率也均大于50%,和Geng等[26]的研究一致,但高于欧洲地区[41]。值得注意的是,在本研究中MSSA菌株的多重耐药率也达到了66.7%,这比之前重庆地区MSSA的耐药率44.4%和北京地区MSSA多重耐药率22.6%均高[34, 42]。其中ST5型MSSA菌株均对5种及以上抗生素耐药,同时携带多种毒力基因,因此多重耐药的MSSA也应该引起高度重视。总之,了解儿童医院ICU金葡菌分离株的分子学特征,有助于发现菌株流行的重要环节线索,为进一步采取有效的感染控制措施阻断其传播及爆发流行提供分子流行病学依据。在ICU病房更要做好金葡菌感染,特别是多重耐药菌株患者的隔离并加强院感控制措施,尽可能避免交叉感染及暴发流行。

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