脓毒症是急性肾损伤 (AKI) 的重要危险因素，是重症监护病房 (ICU) 中AKI发生的最主要原因^[1]。AKI缺乏早期诊断手段，导致AKI的高发病率和高病死率^[2]。有研究显示中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL) 诊断早期AKI的精确性和敏感性均较高^[3-5]。但在脓毒症情况下，血、尿NGAL对AKI发生的诊断试验较少，并且研究结果并不一致^[6-7]。本研究希望用一个入选标准较严格的试验设计，为脓毒症发生AKI的诊断研究提供参考。

2014年7月1日至2014年12月31日入住ICU超过96 h的脓毒症患者为入选病例。排除标准为：⑴ 年龄＜18岁；⑵ 孕妇；⑶ 疾病终末期，包括肿瘤晚期、心功能Ⅳ级 (NYHAⅣ)、呼吸衰竭、肝功能衰竭和严重肾功能损害需紧急肾脏替代治疗 (renal replacement therapy, RRT)；⑷ 严重免疫抑制；⑸ 血液病；⑹ 全身应用抗凝药物；⑺ 患者或亲属不同意参加本研究；⑻ 未按实验设定时点完整留取标本者；⑼ 有肾脏疾病史或就诊后首次检测的血清肌酐 (serum creatine, sCr) 超过正常值 (男≥133 μmol/L；女≥108 μmol/L)。本研究同时在天津市人民医院、天津市天津医院和天津市南开医院三所三级甲等医院开始，并分别获得各自医院伦理委员会的批准。

患者入选后即按照预先设计的数据采集表进行研究数据的采集，数据采集内容包括：人口信息、既往史、并发症、脓毒症的感染病灶、血尿生化指标，以及连续监测的血清和尿液Cr浓度和NGAL浓度。尿NGAL (urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin, uNGAL) 浓度用同时点尿中实测的NGAL值比尿肌酐 (urine creatine, uCr) 值进行校正。

连续监测血清和尿液标本的时点：确诊脓毒症即刻 (0 h)，确诊脓毒症后的12、24、36、48、60、72、84、96 h。每次取血2 mL，1 mL立即送患者所在医院的生化室检测血清肌酐浓度，1 mL放入EDTA抗凝试管，常温下5 000 r/min离心5 min，将血浆取出放入另外的试管中，保存于-70 ℃冰箱；尿液标本每次留取2 mL，立即常温下5 000 r/min离心5 min，上清液均分两份，一份放入另外试管内后存于-70 ℃冰箱，另一份送生化室检测Cr浓度。血清Na⁺、K⁺和Cr检测用全自动生化仪 (Beckman Coulter Dxc800；Beckman Coulter Dxc600，美国Beckman公司) 进行；NGAL检测试剂盒采用人NGAL酶联免疫分析试剂盒 (美国R&D公司)，于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司检测。

将患者入住ICU的首次sCr作为基准值，后续时间点的sCr值升高至可以诊断AKI的时间点即设定为0 h，将0 h前后各时间点按照与0 h距离设定在-48 h和48 h的范围内。

采用2007年中华医学会急诊分会危重病专家委员会制定的脓毒症诊断标准^[8]：确诊的感染或者高度疑似的感染，同时具备下列感染参数的两项以上：⑴ 体温＞38.3 ℃或＜36 ℃；⑵ 心率＞90次/min或＞不同年龄正常心率的2个标准差；⑶ 呼吸频率＞25次/min；以及下列炎症反应参数的一项以上：⑴ 血白细胞计数＞12×10⁹/L或＜4×10⁹/L。白细胞计数正常，但杆状核＞10%，淋巴细胞减少；⑵ C反应蛋白 (CRP)＞正常2个标准差；⑶ 血糖＞7.7 mmol/L而无糖尿病史。急性肾损伤诊断标准采用急性透析质量控制倡议 (ADQI) 小组在2004年第二次国际共识会议中提出的RIFLE标准^[9]。以患者入住ICU时的sCr为基准值，研究期间患者的sCr水平超过基准值1.5倍即确定为AKI。按照急性生理学及慢性健康状况评分系统 (APACHEⅡ) 在入选患者入住ICU即刻对其病情严重程度进行评估。

使用STATA 9.2进行数据分析。计量资料数据符合正态分布数据用均值±标准差 (x±s) 表示，比较用成组t检验或重复测量的方差分析；不符合非正态分布数据用中位数 (M) 加四分位数 (IQR) 表示，比较用Mann-Whitney U检验或Fridman检验。计数资料数据用百分数表示，比较用Fisher精确概率法。计算sNGAL和uNGAL的受试者工作曲线下面积 (area under the receiver operating characteristic curve, AuROC) 来评价这两种标志物鉴别AKI的效能。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

本研究共入选患者50例，年龄27~93岁，男26例，女24例。监测患者进入ICU后各时间点处sCr，其中35例患者进入ICU后于12~96 h之间陆续发生AKI，纳入AKI组；另外15例患者于进入ICU后96 h内均未升至可诊断AKI的水平，纳入非AKI组。两组患者在年龄构成、性别比例差异均无统计学意义，入住ICU时体温、呼吸频率、心率、平均动脉压以及既往史、本次脓毒症的原发感染疾病方面差异均无统计学意义，仅进入ICU时的APACHE Ⅱ评分AKI组明显高于非AKI组 (表 1)。

AKI组的35例患者在入住ICU后的12~96 h的各个时间点处均有sCr升高达到可以诊断AKI的水平，各时间点处AKI的发生例数差异无统计学意义 (图 1)。

图 1 入院后各时间点发生AKI的病例数 (n=35) Figure 1 The number of AKI patients occured at each interval after admission (n=35)

图选项

AKI组患者的sNGAL浓度在诊断AKI前的48 h、36 h明显高于非AKI组，在随后的24 h和12 h处，两组则差异无统计学意义；两组患者的uNGAL水平在AKI发生前后各时间点上差异均有统计学意义 (图 2)。

AKI为急性肾损伤，non-AKI为非急性肾损伤；AKI组和non-AKI组比较，aP < 0.05，bP < 0.01 图 2 sNGAL和uNGAL在两组间各时间点处浓度比较 Figure 2 Comparison of sNGAL and uNGAL concentration at each interval between AKI group and non-AKI group

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对sNGAL预测脓毒症患者发生AKI表现的分析显示，sNGAL在AKI发生前的48 h和36 h的AuROC分别为0.69(95% CI：0.5~0.88) 和0.69(95% CI：0.52~0.87)。sNGAL在这两个时点上的AuROC差异无统计学意义 (图 3)。AKI发生前48 h sNGAL≥2.37 ng/L时，预测AKI发生的敏感度为0.91，特异度为0.47；AKI发生前36 h sNGAL≥2.79 ng/L时，预测AKI发生的敏感度为0.78，特异度为0.53(表 2)。

图 3 sNGAL预测脓毒症患者发生AKI的ROC分析图 Figure 3 Receiver operator characteristic (ROC) curve for serum NGAL in predicting AKI in septic patients

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对uNGAL预测AKI发生的能力分析显示，在AKI发生前的48 h、36 h、24 h和12 h分别为0.83(95% CI：0.70~0.97)、0.75(95% CI：0.59~0.91)、0.83(95% CI：0.70~0.95) 和0.73(95% CI：0.60~0.88)，这四个时点的AuROC差异无统计学意义 (图 4)。uNGAL在AKI发生前的以上四个时间点处预测AKI发生的最佳截断值分别为≥4.85 ng/mgCr (敏感度为0.77；特异度为0.87)、≥4.08 ng/mgCr (敏感度为0.91；特异度为0.53)、≥6.45 ng/mgCr (敏感度为0.54；特异度为1) 和≥4.72 ng/mgCr (敏感度为0.71；特异度为0.67)(表 2)。

图 4 uNGAL预测脓毒症患者发生AKI的ROC分析图 Figure 4 Receiver operator characteristic (ROC) curve for urinary NGAL in predicting AKI in septic patients

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以入住ICU时作为基准时间点，则sNGL和uNGAL在入住ICU后的各时间点浓度对脓毒症患者发生AKI的预测分析结果显示，无论sNGAL还是uNGAL，入住ICU后的前四个时间点，入住ICU即刻 (0 h)、12 h、24 h和36 h均不具备预测AKI发生的能力 (表 3)。按照血、尿标本采集时间顺序分析各时间点NGAL预测AKI发生的能力，则sNGL和uNGAL在入住ICU后的前4个时间点，入住ICU即刻 (0 h)、12 h、24 h和36 h sNGAL或uNGAL，均对脓毒症患者发生AKI没有预测能力 (表 3)。

目前监测AKI依然依赖sCr和肾小球滤过率 (glomerular filtration rate, GFR)^[10]，而sCr和GFR不能及时、敏感地反映肾脏细胞损伤^[11]，不能及时诊断AKI即不能及时采取治疗措施，因此AKI仍是ICU中高发病率和高病死率的一种疾病^[12]。

研究显示NGAL是AKI较好的预测因子^[5]，但结论多由心脏手术中心脏的缺血-再灌注损伤或肾毒性药物导致AKI的诊断试验获得。关于脓毒症导致AKI的诊断价值研究仍较少^[4]。并且现有的关于NGAL预测脓毒症患者发生AKI的结论并不一致。Zappitelli等^[13]发现uNGAL对于ICU中的儿童患者是一个非常有用的预测AKI的生物标志物。Wheeler等^[7]对NGAL对于脓毒症患者发生AKI的诊断价值进行了研究，他们的一个多中心临床研究结果显示，血清NGAL (sNGAL) 对于脓毒性休克患儿发生AKI有很高的敏感性。其后的一项研究证实血浆NGAL (pNGAL) 是预测不同病因的成年ICU患者发生AKI的有用的早期生物标志物，并且研究者发现，pNGAL可在临床诊断AKI48 h之前做出预测^[14]。Bagshaw等^[15]观察了脓毒症导致AKI患者与非脓毒症病因导致AKI患者的pNGAL和uNGAL浓度变化，发现在研究对象入选时，脓毒症AKI患者的pNGAL明显高于非脓毒症AKI患者；而uNGAL在脓毒症AKI患者中的浓度始终高于非脓毒症AKI患者。pNGAL能很好地识别脓毒症患者AKI的进展患者以及需要进行RRT治疗的患者。虽然uNGAL在识别脓毒症患者AKI进展和需要RRT治疗方面表现略逊色，但研究者仍认为uNGAL是脓毒症患者预测AKI发生的很好的生物标志物。在Martensson等^[4]的研究中，研究结果肯定了uNGAL对脓毒症患者发生AKI的预测价值，但pNGAL在系统性炎症反应 (SIRS)、严重脓毒症和脓毒性休克时虽有升高，对AKI发生没有预测作用。分析以上文献，NGAL在脓毒症患者发生AKI的诊断试验结果不一致的原因，可能是研究设计上的不一致，或者设计不合理。有的研究不考虑AKI发生的时间，只是按照入选患者生物标志物监测的时间来评价血、尿NGAL指标^{[7, 13]}；有些只观察血或尿一种来源的NGAL^{[7, 14-15]}；有的研究入选患者病情较重^{[6, 14]}。但脓毒症的发生并不能像心肌缺血-再灌注损伤和肾毒性药物损伤在时间上容易确定；脓毒症发生后应用的治疗、治疗方式、治疗强度不同以及入选患者的病情轻重程度不一均会对试验结果造成影响。可见针对脓毒症患者发生AKI的诊断试验干扰因素很多，研究设计方案需要规范和细化。

综合以往临床试验设计方案的优劣，本研究采用了以往文献临床试验设计中采用的时间模型^{[4, 13]}，即将研究对象中发生AKI的时间设定为基点时间，评价基点时间前各时间点处检测的标志物的诊断能力。这种模型的好处是不必考虑脓毒症开始时间这个不确定因素。本研究的结果，与以上三个临床研究结果相近，sNGAL和uNGAL均是较好的AKI预测因子。在本研究中，也对以患者入住ICU时间为起始时间的各时间点处标志物的诊断能力做了评价，结果显示采用这样的时间模型，血、尿标志物的诊断价值均较低。这两种时间模型的分析结果相差悬殊，说明了设计方案对研究结果是有影响的。

本研究结果证实了sNGAL和uNGAL对脓毒症患者发生AKI均有较好的预测能力。虽然两种标志物在预测能力上的差异无统计学意义，但uNGAL还是表现了较好的AKI预测能力的趋势，这不仅表现在AuROC数值较高，还表现在uNGAL在AKI发生的多个时间点上都有诊断价值，而sNGAL只有AKI发生前的48 h和36 h。这个细微的差异可能与血清和尿中的NGAL来源有关。NGAL可由活化的中性粒细胞产生，部分组织细胞如肝、肺、肾和直肠等的上皮细胞在受损后也有表达^[16]，当这些细胞受到急性损伤时，NGAL的表达会大幅提高^[17]。因此血清中的NGAL来源于整个机体，而尿中的NGAL来源于全身可释放NGAL的细胞，以及局部的高浓度来自于受损肾小管上皮细胞的NGAL^[18]。

本研究中的各个时间点处，AKI组患者的uNGAL水平均高于非AKI组；但sNGAL水平只是在AKI发生前的48 h和36 h显著高于非AKI组，可能是由于本研究的入选患者均经过治疗好转出院，研究开始时病情较重，全身炎症反应较剧烈，因此在脓毒症患者入ICU后的两个时间点sNGAL较高，经治疗病情减轻，炎症反应减弱，sNGAL水平也相应的下降了，这与笔者另外的一项评价sNGAL对社区感染性肺炎发生AKI的诊断价值研究中的结果中sNGAL水平变化趋势相同^[19]。而uNGAL水平在各个时间点间的变化并不明显，可能原因是肾脏上皮细胞受损，肾小管上皮细胞持续分泌NGAL以对抗炎症反应的侵袭^[20]和参与肾小管上皮的修复^[21]有关。

本研究中存在的不足是研究样本较小，以致本研究结果的代表性不强。因为本研究的入选标准设定较严格，这样设计是因为脓毒症在发病时间、诱发因素、研究期间的治疗方式以及脓毒症患者的合并症较多，为能使研究结果更精确，只能选取脓毒症患者中特定部分人群。