中华急诊医学杂志  2017, Vol. 26 Issue (5): 533-537
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廖瑾莉, 熊艳, 刘志豪, 张婉婉, 祝锋, 詹红, 徐嘉. 慢性华支睾吸虫感染极化M2型巨噬细胞对脓毒症大鼠肺脏保护作用的研究[J]. 中华急诊医学杂志, 2017, 26(5): 533-537.
Liao Jinli, Xiong Yan, Liu Zhihao, Zhang Wanwan, Zhu Feng, Zhan Hong, Xu Jia. Protective effects of chronic clonorchis sinensis infestation on lungs of septic rat via M2 macrophages polarization[J]. Chin J Emerg Med, 2017, 26(5): 533-537.
慢性华支睾吸虫感染极化M2型巨噬细胞对脓毒症大鼠肺脏保护作用的研究
廖瑾莉, 熊艳, 刘志豪, 张婉婉, 祝锋, 詹红, 徐嘉     
510080 广州，中山大学附属第一医院急诊科
收稿日期: 2016-12-21
基金项目: 广东省医学科学技术研究基金 (A2015486)；广东省科技计划项目 (2012B031800366)；广东省自然科学基金 (S2013010015328)
通信作者: 徐嘉，Email:2828stone@sina.com.
摘要: 目的 初步探讨慢性华支睾吸虫 (clonorchis sinensis，Cs) 感染对脓毒症大鼠肺脏保护作用及其机制。 方法 经口Cs虫卵灌胃建立慢性Cs感染SD大鼠模型，细胞流式技术检测慢性Cs感染组和正常对照组腹腔巨噬细胞 (Mφ) 亚型，RT-PCR法检测Ⅰ型精氨酸酶 (Arg-1)、发现炎症区域1(FIZZ 1)、诱导型一氧化氮合酶 (iNOs)、肿瘤坏死因子 (TNF-α) 和白细胞介素-10(IL-10) mRNA的表达；结肠结扎穿孔术 (cecal ligation and puncture，CLP) 建立SD大鼠脓毒症模型，分为空白对照组、假手术组、脓毒症组，正常腹腔Mφ过继转移组、慢性Cs感染腹腔Mφ过继转移组和慢性Cs感染组。统计各组大鼠72 h累积病死率，观察肺脏病理变化，ELISA法检测CLP术后0、24、48和72 h血清TNF-α和IL-10的水平。 结果 正常大鼠腹腔Mφ以M1为主 (91.9%)，慢性Cs感染组大鼠腹腔Mφ则向M2极化 (95.1%)。iNOS mRNA在M1中高表达，在M2中基本不表达；Arg-1、FIZZ 1和IL-10 mRNA在M2表达明显高于M1，TNF-α mRNA在M1中的表达高于M2 (P＜0.05)。慢性Cs感染和M2腹腔过继转移组脓毒症大鼠的72 h病死率下降 (P＜0.05)，肺组织炎症损伤减轻，血清促炎因子TNF-α水平下降，抑炎因子IL-10水平上升 (P＜0.05)。 结论 慢性Cs感染大鼠的M2型巨噬细胞极化可降低脓毒症时血清的促炎因子水平，提高抑炎因子水平，改善肺脏病理损伤，对脓毒症发挥保护作用。
关键词: 脓毒症     慢性华支睾吸虫感染     替代活化型 (M2) 巨噬细胞     细胞因子     基因表达    
Protective effects of chronic clonorchis sinensis infestation on lungs of septic rat via M2 macrophages polarization
Liao Jinli, Xiong Yan, Liu Zhihao, Zhang Wanwan, Zhu Feng, Zhan Hong, Xu Jia     
Department of Emergency, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China
Corresponding author: Xu Jia, Email:2828stone@sina.com
Abstract: Objective To preliminarily investigate the protective effect of chronic clonorchis sinesis (Cs) infestation against sepsis in Sprague Dawley (SD) rats in order to explore its underlying mechanism. Methods Chronic Cs infestation model of SD rats was reproduced by intra-gastric administration with Cs ova.Twenty rats were randomly (random number) divided into normal group (n=10) and Cs group (n=10). The proportion of differentiation in M1 and M2 macrophages were detected by flow cytometry. The expressions of Arg-1(arginine-1), FIZZ 1, iNOs and TNF-αmRNA were examined by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).The cecal ligation and puncture (CLP) procedure was performed to reproduce sepsis model of SD rats. Sixty rats were randomly (random number) divided into control group, SHAM group, CLP group, Mφ+CLP group, Cs-Mφ+CLP group, and Cs-CLP group. The cumulative mortalities were calculated. The pathological changes of the lung tissue in different groups were demonstrated by HE staining. The serum levels of cytokines TNF-α and IL-10 were detected by ELISA at 0, 24, 48 and 72 h after CLP procedure. Results Compared with M1 peritoneal macrophages differentiation in control group (91.9%), rat peritoneal macrophages were activated to M2 differentiation (95.1%) in chronic Cs infection group. RT-PCR assay showed expression of Arg-1 and FIZZ 1 mRNA were higher in M2 macrophages, and on the contrary, the expression of iNOS mRNA expression was higher in M1 macrophages. The expression of TNF-α mRNA in M1 was significantly higher than that in M2, whereas the expression of IL-10 mRNA in M2 was higher than that in M1.The cumulative mortality of septic rats 72 h after CLP procedure were much lower in both chronic Cs infestation group and M2 macrophages adoptive transfer group (CLP group 70% vs.Mφ+CLP group 50% vs.Cs-Mφ+CLP group 30% vs.Cs-CLP group 0%, P < 0.05).In these two groups, the pathological damages in lung tissues were significantly improved. The serum level of TNF-α was decreased and the anti-inflammatory IL-10 level was increased significantly in these two groups with Cs compared with other groups. Conclusion M2 macrophages polarization induced by chronic Cs infestation with M2 phenotype gene and expression of anti-inflammatory cytokine gene play key role in increasing anti-inflammatory cytokines and decreasing pro-inflammatory cytokines to allerviate organ damage and ameliorating the survival rate in septic rats.
Key words: Sepsis     Chronic clonorchis sinensis infection     Alternatively activated macrophages (M2)     Cytokines     Gene expression    

脓毒症 (sepsis) 是感染引起的全身炎症反应综合征 (sysmetic inflammatory response syndrome，SIRS)，治疗困难，病死率高，其主要致病机制之一是发病过程中感染造成的大量炎症因子过度释放导致的炎症失控和免疫失衡。以往拮抗单一细胞因子的治疗未取得理想效果，而免疫调节治疗的研究往往局限于某些药物或免疫系统的某个环节，效果并不确切[1]。慢性蠕虫感染调节宿主机体免疫向Th2方向极化，产生的IL-4、IL-13等Th2型抑炎因子可以招募并诱导M2型巨噬细胞，发挥控制炎症和组织修复的作用。本研究旨在利用慢性华支睾吸虫 (clonorchis sinensis，Cs) 感染模型及腹腔巨噬细胞过继转移揭示具有免疫调节作用的M2型巨噬细胞对脓毒症大鼠的保护作用及其机制。

1 材料与方法 1.1 动物实验及分组

清洁级雄性SD大鼠 (160~180 g) 共80只，购自中山大学北校区实验动物中心，随机 (随机数字法) 分为正常大鼠组10只，慢性Cs感染组10只，进行腹腔巨噬细胞亚型分析。其余60只大鼠分为空白对照组、假手术组、脓毒症组、正常腹腔Mφ过继转移组、慢性Cs感染大鼠腹腔Mφ过继转移组和慢性Cs感染组，每组各10只。感染华支睾吸虫囊蚴的麦穗鱼取自中山医学院寄生虫实验室生态池。

1.2 主要试剂及仪器

高糖型DMEM、RPMI1640、DPBS和不含Ca2+、Mg2+的HBSS均购于Gibco公司；大鼠TNF-α和IL-10的ELISA检测试剂盒购于Bender MedSystems公司；抗大鼠PE-Cy5F4/80，大鼠PE-CD16/32抗体购于eBioscience公司；大鼠FITC-CD206抗体购于Santa Cruz公司；苏木精-伊红 (HE) 染色剂由中山大学附属第一医院病理科提供；消化液由中山医学院寄生虫教研室保存；检测仪器包括美国BIO-RAD公司的MODEL 550型酶标仪；北京医用离心机厂的台式离心机；美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪；珠海黑马医学仪器有限公司的Hema9600 PCR扩增仪。

1.3 实验方法 1.3.1 建立慢性华支睾吸虫感染模型

(1) 华支睾吸虫囊蚴的收集具体方法参照文献[2]进行。挑取活囊蚴用于慢性Cs感染造模。(2) 囊蚴攻击感染SD大鼠致肝吸虫慢性感染模型具体操作参照文献[2]进行，感染后第70天收集大鼠粪便检出虫卵证实感染模型建造成功。

1.3.2 结肠结扎穿孔 (CLP) 手术建立脓毒症模型

全部大鼠术前12 h禁食不禁水，术后自由进食饮水，在距回肠盲端1.5~2 cm处以4号丝线环形结扎盲肠根部，保持肠道通畅，用18号针头一次贯通穿刺，然后纳入腹腔，逐层缝合。术后立即给予皮下注射生理盐水 (5 mL/100 g) 补液治疗，自由饮食和活动。假手术组仅行剖腹与回肠盲端探查。

1.3.3 腹腔巨噬细胞的收集和过继转移

具体操作参照参考文献[2]进行，正常大鼠组和慢性Cs感染组腹腔巨噬细胞 (2×106/只)，分别经腹腔过继转移于正常SD大鼠24 h后行CLP术脓毒症造模。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞膜蛋白表达

各组腹腔巨噬细胞调整至5×105/管，PBS洗1次，100 μL PBS重悬，加入抗大鼠PE-Cy5F4/80抗原，诱导刺激后加入小鼠FITC-CD206抗体和小鼠PE-CD16/32抗体，避光室温孵育30 min，PBS洗3次，PBS 200 μL重悬后上流式细胞仪检测。

1.3.5 RT-PCR检测巨噬细胞表面标志Arg-1、FIZZ 1和炎症因子iNOs、TNF-α、IL-10的mRNA表达

按试剂盒说明书提取总RNA，反转录合成cDNA第一链。以cDNA为模板扩增iNOs、Arg-1、FIZZ 1、TNF-α、IL-10的基因编码片段，β-actin为内参，扩增条件如下：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，30个循环，72 ℃延伸10 min，PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶、0.5×TBE缓冲液中恒压100 V电泳检测，凝胶成像仪照相记录。引物由北京鼎国生物科技有限公司合成，见表 1。

表 1 引物序列 Table 1 Sequences for primers
基因 序列 长度
IL-10 Forward 5’- CTTTCACTTGCCCTCATCC-3’ 265 bp
Reverse 5’- ACAAACAATACGCCATTCCC-3’
TNF-α Forward 5’-CCCAGACCCTCACACTCAGATCAT-3’ 259 bp
Reverse 5’-GCAGCCTTGTCCCTTGAAGAGAA-3’
iNOs Forward 5’-GAATTCCCAGCTCATCCGGT-3’ 349 bp
Reverse 5’-GGTGCCCATGTACCAACCGGT-3’
Arg-1 Forward 5’-CCGCAGCATTAAGGAAAGC-3’ 71 bp
Reverse 5’-CCCGTGGTCTCTCACATTG-3’
FIZZ 1 Forward 5’-CTATCCCTCCACTGTAACGAAG-3’ 181 bp
Reverse 5’-AGTGGTCCAGTCAACGAGTAAG-3’
β-actin Forward 5’-CAGTAACAGTCCGCCTAGAA-3’ 175 bp
Reverse 5’-GATTACTGCTCTGGCTCCTA-3’
表选项
1.3.6 细胞因子的检测

留取各组大鼠CLP术后0、24、48和72 h血清，-80 ℃保存。严格按照ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.3.7 肺组织病理学评分

各组大鼠CLP术后0、24、48和72 h活杀后取肺组织，标本切片，HE染色，光学显微镜下观察肺泡充血，肺内出血，血管壁肺间隙中性粒细胞集聚或浸润，肺泡壁增厚或透明膜形成等病理变化，参照Nishina等[3]的评分标准进行肺组织的病理评分。

1.4 统计学方法

用SPSS 16.0软件进行统计学分析。生存分析采用Kaplan-Meier来进行不同组别生存率的比较。计量数据以均数±标准差 (x±s) 表示。两组计量资料比较采用成组t检验，两组以上计量资料比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 正常对照组与慢性肝吸虫感染组的腹腔巨噬细胞亚类分析

正常对照组大鼠的腹腔巨噬细胞以M1型为主，比例为92.1% (图 1A)，而慢性Cs感染组大鼠的腹腔巨噬细胞向M2型极化，比例为93.8% (图 1B)。

A: M1 型巨噬细胞; B: M2型巨噬细胞 图 1 正常对照组与慢性Cs感染组腹腔不同类型巨噬细胞的分化纯度 Figure 1 The differentiation proportion of different type of peritoneal macrophages from normal group (A) and chronic Cs-infected group (B)
图选项
2.2 不同巨噬细胞表面标志Arg-1、FIZZ 1和炎症因子iNOs、TNF-α、IL-10的mRNA表达

RT-PCR检测结果显示M1和M2中不同表型分子和炎症因子的mRNA表达量：iNOS (2.54±0.33) vs. (0.11±0.02)；Arg-1 (0.15±0.04) vs. (0.42±0.08)；FIZZ 1 (0.14±0.03) vs. (0.44±0.09)；TNF-α (0.88±0.11) vs. (0.11±0.02)；IL-10 (0.13±0.02) vs. (0.35±0.04)，差异均有统计学意义 (P＜0.05)(图 2)。

与M1型巨噬细胞比较，aP＜0.05 图 2 正常对照组和慢性Cs感染组腹腔不同类型巨噬细胞表面标志和炎症因子mRNA表达 Figure 2 The mRNA expressions of marker phenotypic molecule and inflammatory factor in different type macrophages
图选项
2.3 各组大鼠72 h累计病死率的比较

空白对照组、假手术组、脓毒症组、正常腹腔Mφ过继转移组、慢性Cs感染腹腔Mφ过继转移组和慢性Cs感染组大鼠CLP术后72 h的累计病死只数分别为0、0、7、7、3和0只 (表 2)，经Kaplan-Meier法生存分析检验，差异有统计学意义 (P＜0.05)。

表 2 各组大鼠CLP手术后72 h累计病死率的比较 Table 2 The comparison of cumulative mortality rates of rats 72 h after CLP procedure in different groups
时点
(h)		 累计病死只数
对照组 SHAM组 CLP组 Mφ+CLP组 Cs-Mφ+CLP组 Cs-CLP组
24 0 0 6 4 3 0
48 0 0 7 5 3 0
72 0 0 7 7 3 0
  注：6组小鼠72 h累计病死率差异有统计学意义，P＜0.05
表选项
2.4 各时点血清TNF-α和IL-10水平的比较

TNF-α和IL-10在空白对照组和假手术组各时点水平均较低。CLP组血清TNF-α水平在各时点均较对照组明显升高 (P＜0.05)，24 h达到峰值。M1过继转移组大鼠血清TNF-α的变化趋势与CLP组相似，而M2过继转移组和慢性Cs感染组大鼠CLP术后各时点血清TNF-α水平较CLP组和M1过继转移组均明显下降 (P＜0.05)。CLP组脓毒症大鼠血清IL-10水平在术后24 h降至最低，且低于对照组 (P＜0.05)，48 h后随时间稍有回升，M1过继转移组大鼠CLP术后血清IL-10水平较对照组也明显降低，且从0 h至72 h呈逐渐下降趋势，在各时点均低于CLP组 (P＜0.05)。慢性Cs感染组和M2过继转移组大鼠的IL-10在0 h的基础水平较对照组已明显升高 (P＜0.05)，在CLP术后24 h下降，但之后随时间逐渐上升，且在各时点均明显高于M1型巨噬细胞过继转移组和CLP组 (P＜0.05)，见表 3。

表 3 各组大鼠不同时间点血清细胞因子TNF-α和IL-10水平的比较(n=10, x ±s) Table 3 Comparison of serum levels of cytokines TNF-α and IL-10 in rats from different groups at different intervals(n=10, x ±s)
组别 TNF-α(ng/L) IL-10(ng/L)
0 h 24 h 48 h 72 h 0 h 24 h 48 h 72 h
对照组 51.47±1.99 51.49±2.19 49.55±2.16 49.90±1.60 45.45±2.73 44.94±1.67 46.36±2.28 47.96±1.92
假手术组 50.67±2.54 57.20±2.12 56.09±1.43 52.23±3.07 48.85±1.93 50.79±1.52 49.60±2.40 54.47±2.42
CLP组 57.34±2.89 212.83±16.61a 130.02±12.88a 100.78±3.61a 54.16±3.36 41.23±1.76 51.85±2.43a 60.11±1.89a
MΦ+CLP组 53.22±1.73 211.75±13.73a 148.62±8.16ab 120.28±2.95ab 51.62±2.97 32.33±2.11ab 27.69±1.92ab 21.38±1.49ab
Cs-Mφ+CLP组 52.47±1.63 122.82±11.35abc 75.16±4.66abc 70.56±2.09abc 159.09±3.52abc 113.65±4.36abc 140.76±3.15abc 179.05±3.46abc
Cs-CLP组 74.87±2.69ac 106.51±6.77abc 80.65±3.62abc 84.88±2.76abc 179.19±4.39abc 124.81±4.31abc 159.18±3.69abc 177.61±3.66abc
注：与对照组比较，aP＜0.05；与CLP组比较，bP＜0.05；与Mφ+CLP组比较，cP＜0.05
表选项
2.5 各组大鼠各时点肺组织病理变化

对照组和假手术组肺组织结构完整，无明显炎症病理损伤 (病理图片未显示)；CLP术后72 h，脓毒症组可见弥漫的炎性细胞浸润，明显的肺水肿、出血以及肺不张，肺泡间隔明显增厚，有明显透明膜形成。M1过继转移组肺组织的病理损害与CLP脓毒症类似；而M2过继转移组和慢性Cs组大鼠肺脏各时点的病理损害明显减轻。各组评分差异有统计学意义 (P＜0.05)，见图 3。

A:CLP组;B: Mφ+CLP组;C: Cs-Mφ+CLP组;D:Cs-CLP组;E:肺损伤评分；n=10；与对照组比较，aP＜0.05；与CLP组比较，bP＜0.05 图 3 各组大鼠72 h肺组织病理变化(HE×200) Figure 3 The pathological changes of pulmonary in rats of different groups 72 h after CLP procedure (HE×200)
图选项
3 讨论

慢性Cs感染可使与宿主的免疫应答反应向Th2方向极化，进而造成慢性免疫损伤[4]。以往的研究已经证实，慢性Cs感染大鼠的血清抗体以IgE和IgG1亚类为主，IL-4和IL-13等抑炎因子明显升高，而促炎因子TNF-α和IFN-γ明显降低[5]。已证明一些免疫细胞和细胞因子在慢性蠕虫感染诱导宿主Th2免疫应答中发挥重要作用，如IL-4可以可诱导Th0向Th2分化，促进B细胞活化和免疫球蛋白类型转化[6]。虫源性抗原抑制树突状细胞 (dentritic cells，DCs) 细胞的发育成熟，进一步提呈更有利于Th2方向分化的信号分子[7]。

作为对抗病原体感染的天然免疫应答过程中的重要细胞，巨噬细胞的表型和功能的改变对炎症反应的作用越来越受到重视。巨噬细胞存在一系列连续的功能状态，经典活化型 (M1型) 和替代活化型 (M2型) 是这一连续状态的两个极端，其中M1型由未分化的M0经IFN-γ和LPS刺激分化而来，是主要的抗原提呈细胞，发挥吞噬病原体、激活炎症反应和组织损伤的作用；而由IL-4、IL-13等刺激分化而来的M2型主要发挥抑制炎症反应、组织修复和血管生成的生物学作用。慢性Cs感染的Th2免疫应答释放IL-4、IL-13和IL-10等细胞因子的微环境更有利于M2型巨噬细胞的极化。M1型巨噬细胞主要表达iNOS和膜蛋白CD16/32，而Arg-1、FIZZ 1和CD206是鉴定M2型巨噬细胞较为理想的表型指标[10]。

笔者设想慢性Cs感染引起的Th2免疫应答偏移，M2型巨噬细胞极化和相关细胞因子可能发挥抑制脓毒症炎症病理损伤，提高生存率的作用。通过腹腔巨噬细胞过继转移实验初步证实了M2型巨噬细胞是抗炎修复和保护脓毒症的关键细胞。慢性Cs感染大鼠腹腔巨噬细胞表达的表面分子Arg-1、FIZZ-1和细胞因子IL-10与M2型表型变化一致，全部大鼠在脓毒症后72 h达到100%的生存率，腹腔过继转移M2型巨噬细胞同样对脓毒症大鼠发挥了保护作用，72 h累计病死率下降至3/10，与CLP组比较，主要脏器肺脏的病理损伤明显减轻，且血清促炎因子TNF-α明显下降，抑炎因子IL-10的水平明显上升。而过继转移高表达TNF-α和iNOS的M1型巨噬细胞的脓毒症大鼠72 h累计病死率仍高达7/10，脏器炎症病理损伤无明显改善，血清炎症因子表达状况与脓毒症组类似。TNF-α是脓毒症发病中早期关键的致病因子，iNOS是核因子NF-κB的下游效应分子，由iNOS介导的炎症介质一氧化氮 (NO) 的过度释放是引起脓毒症休克的重要机制，而M1型巨噬细胞特有的iNOS与缺乏Arg-1密切相关，而巨噬细胞缺乏表达Arg-1的小鼠不能抵制机体发生的急性炎症反应[11]；M2型巨噬细胞则高表达Arg-1而缺乏iNOS，并通过表达Arg-1和抵抗素样分子-α (RELM-α) 等发挥对炎症的抑制作用。既往研究证实，M2型巨噬细胞通过分泌抗炎因子IL-4、IL-10等在病毒性心肌炎、急性肾炎等的发病过程中起到了保护作用，但对全身性系统性感染如脓毒症保护作用的研究还很少。

本研究显示蠕虫感染通过改变宿主机体免疫状态对脓毒症过度炎症整体下调，可以显著降低脓毒症的病死率，这为脓毒症的治疗提供了新策略，其中M2型巨噬细胞在脓毒症的免疫平衡和抑制过度炎症的过程中可能发挥了枢纽作用。这些研究结果提示可以通过生物信息学分析等方法，筛选具有免疫调节特性的蠕虫蛋白，优化脓毒症治疗的策略，具体机制更有待于我们后续实验的深入进行。

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