2017, Vol. 26
急性肾损伤 (acute kidney injury，AKI) 是创伤失血性休克 (traumatic hemorrhagic shock，THS) 常见的并发症之一，具有较高的病死率并且影响患者的预后[1]。当创伤失血性休克发生时，常伴有细胞凋亡[2]，而活性氧引起的氧化应激在细胞凋亡的环节中起重要作用[3]，它也是造成急性肾损伤的重要因素。而在细胞凋亡的过程中，线粒体介导的细胞凋亡尤为重要[4]。我国西北地区夏季以干热为主导气候，人们在该环境下高强度劳动，可使机体出现热应激，它可以导致器官功能障碍并威胁人们生命，而AKI便是其常见的并发症之一[5]。笔者前期研究发现，沙漠干热环境下大鼠肾功能出现改变，同时肾组织病理发现肾组织血管扩张、血栓形成、出现管型等[6]。这些研究表明干热环境对机体带来的危害不容小觑。因而，为更好了解干热环境合并创伤失血性休克时对人机体的影响，同时更好模拟人体病理生理学疾病变化特点，本研究选用长白仔猪作为模型动物，主要因为其遗传稳定性较好，适用于制作人类多种疾病的动物模型尤其是创伤模型。同时，与大鼠相比，猪的解剖结构和生理与人相似，更适合从细胞、组织到器官系统水平研究干热环境下创伤性失血性休克对机体肾脏病理生理学变化特点。目前，对于干热环境合并创伤失血性休克发生时继发性肾损伤的发病机制尚未阐明。因此，本研究从氧化应激及Caspase-3的变化去探讨干热环境合并创伤失血性休克时肾脏功能的改变及导致其损伤机制，为临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物与分组雄性健康长白仔猪48头，体质量 (30±5) kg，购买后在新疆军区总医院实验动物科大动物饲养室1周，温度 (25±1) ℃, 湿度 (35±5)%。利用随机数字表将动物随机分成2组：干热创伤失血性休克组 (DHS，n=24) 和常温创伤失血性休克组 (RTS，n=24)，DHS组在西北特殊环境人工实验舱 (由新疆军区总医院研制) 中暴露3 h，温度 (40.5±0.5)℃, 湿度 (10±2)%，且将DHS组随机 (随机数字法) 分为4个亚组：T0 (实验舱中暴露3 h，n=6)、T1 (休克模型成功50 min，n=6)、T2 (休克模型成功100 min，n=6)、T3 (休克模型成功150 min，n=6)；RTS组在实验舱中暴露3 h，温度及湿度分别设置：(25±1)℃, (35±5)%，同样将RTS组分为4个亚组，具体时间点与DHS组一致。本研究经新疆军区总医院伦理与福利委员会同意批准。
1.2 模型建立术前动物臀大肌注射氯胺酮 (20 mg/kg) (福建吉田药业有限公司) 和阿托品 (0.05 mg/kg)(天津金耀药业有限公司)，耳缘静脉静推维库溴铵 (20 μg/kg)(浙江仙琚制药股份有限公司)。气管插管 (直径为7 mm) 后接德国Drager公司麻醉机辅助呼吸，吸入氧体积分数约47%，潮气量为8~10 mL/kg，根据呼气末二氧化碳压 (ETCO2) 调整呼吸频率，维持在35~45 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)[7]。穿刺双侧髂外动脉穿刺用于监测血压和放血，膀胱造瘘收集尿液。取腹正中切口，切除脾脏、称质量并输入3倍脾重的乳酸林格液，及肝左下叶1/4，放血使平均动脉压维持在 (45±5) mmHg，稳定20 min后记为T0时。在相应时间点用3%戊巴比妥钠注射液 (Sigma公司) 处死休克猪，取血行生化检查；取肾组织，一部分置于10 %中性甲醛溶液中固定行肾组织形态学检查，另一部分投入液氮中冻存行肾组织氧化应激检查；取尿液置于1.5 mL EP管中，在-80 ℃冰箱中保存。
1.3 检测方法 1.3.1 肾损伤指标检测收集静脉血2 mL室温稳定，血液完全凝集后离心 (4 000 r/min，5 min)，用迈瑞 (型号：BS-180) 生化分析仪检测BUN及肌酐。取尿液标本1 mL室温稳定后低速离心 (1 500 r/min，5 min)，利用尿NGAL (型号：Kit 044) 检测试剂盒 (BIOPORTO公司、丹麦) 检测。
1.3.2 肾脏组织学检测取部分肾组织于10%中性甲醛溶液中固定48 h，经酒精脱水制作石蜡包埋蜡块，切片后用苏木精-伊红染色，中性树胶封片。在双盲情况下由两名病理学专家在光镜下 (200倍) 观察组织形态。
1.3.3 肾小管损伤评分光镜下随机选取10个高倍视野，按照Paller评分[8]标准评价肾小管损伤情况。评分标准如下：肾小管明显扩张，细胞扁平记1分；刷状缘损伤记1分，脱落记2分；细胞质空泡记1分；间质水肿记1分；小管腔内有脱落的坏死细胞，未形成管型或碎片记1分，形成管型或碎片记2分。
1.3.4 肾脏组织透射电镜扫描取大小约为1 mm×1 mm×3 mm的肾皮质于新鲜固定液中，放入4 ℃冰箱低温固定，经组织固定、脱水、置换、渗透、包埋、聚合、修块、切片、染色等处理后，在透射电镜 (JEOL 1230电子显微镜) 下观察肾脏线粒体变化。
1.3.5 氧化应激指标检测液氮中取出0.1 g冻存肾脏组织，玻璃匀浆器研磨制备10%的组织匀浆，利用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，检测肾组织中CAT、SOD及MDA含量。
1.3.6 肾组织caspase-3蛋白含量检测液氮中取出0.1 g冻存肾脏组织，液氮环境下研磨至无块状，加入1 mL裂解液在冰上裂解2 h，离心 (12 000 r/min，15 min) 取上清液，按照1: 1比例加入2×上样缓冲液在沸水中煮沸8 min，离心后取上清液在-80 ℃中保存。利用Western Blot法检测肾组织caspase-3表达，检测前蛋白定量，电泳、转印及孵育后利用化学发光法进行图像采集，通过灰度分析，比较各组蛋白caspase-3表达情况。
1.4 统计学方法采用SPSS 21.0软件进行统计分析，满足正态分布的计量资料以均数±标准差 (x±s) 表示，采用方差分析 (LSD-t法) 比较相同时间点不同组间差异是否有统计学意义，单独组间比较采用成组t检验；采用Pearson相关分析法进行相关性分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 肾损伤指标变化DHS与RTS组相比，在T0、T1时间点，BUN和肌酐均有所升高，但差异无统计学意义 (P > 0.05)，到T2和T3时间点，差异有统计学意义 (P < 0.05)。而评价肾损伤的早期指标NGAL，在T1时间差异有统计学意义 (P < 0.05)，见表 1。
| 指标 | T0 | T1 | T2 | T3 | ||||||||||||
| DHS组 | RTS组 | F值 | P值 | DHS组 | RTS组 | F值 | P值 | DHS组 | RTS组 | F值 | P值 | DHS组 | RTS组 | F值 | P值 | |
| BUN(mmol/L) | 3.87±0.21 | 3.78±0.25 | 0.757 | 0.54 | 4.15±0.24 | 3.96±0.26 | 0.012 | 0.221 | 4.81±0.22 | 4.06±0.16 | 0.703 | ＜0.01 | 6.59±0.46 | 4.73±0.14 | 11.59 | 0.007 |
| 肌酐(μmol/L) | 98.47±3.83 | 93.17±4.56 | 0.285 | 0.054 | 104.03±3.54 | 98.90±6.04 | 0.852 | 0.103 | 128.68±3.38 | 102.73±1.46 | 2.181 | ＜0.01 | 152.37±4.12 | 107.21±0.78 | 4.93 | ＜0.01 |
| NGAL(pg/mL) | 12 810.12±1 868.83 | 10 973.29±883.37 | 5.018 | 0.055 | 46 543.94±906.06 | 17 003.36±891.94 | 0.193 | ＜0.01 | 52 880.03±1 238.05 | 22 319.33±1 035.65 | 0.205 | ＜0.01 | 75 099.57±2 626.49 | 28 981.23±1 324.48 | 1.82 | ＜0.01 |
| CAT(U/mgprot) | 247.30±4.39 | 251.54±3.05 | 1.207 | 0.08 | 243.74±2.84 | 249.91±2.37 | 0.273 | 0.002 | 228.90±1.99 | 245.28±1.71 | 0.391 | ＜0.01 | 193.44±11.07 | 239.75±6.71 | 1.363 | ＜0.01 |
| SOD(U/mgprot) | 402.04±2.76 | 406.58±4.46 | 2.856 | 0.06 | 395.87±3.21 | 405.37±3.23 | 0.002 | ＜0.01 | 382.00±1.22 | 398.94±1.36 | 0 | ＜0.01 | 365.87±3.58 | 393.87±6.48 | 2.549 | ＜0.01 |
| MDA(nmol/mgprot) | 1.72±0.04 | 1.64±0.09 | 4.159 | 0.079 | 1.80±0.05 | 1.71±0.05 | 0.22 | 0.011 | 2.78±0.11 | 2.00±0.10 | 0.015 | ＜0.01 | 3.81±0.10 | 2.25±0.08 | 0.102 | ＜0.01 |
| Paller评分(分) | 2.17±0.75 | 1.33±0.82 | 0.225 | 0.096 | 4.00±0.89 | 2.17±0.75 | 0.16 | 0.003 | 4.83±0.75 | 3.17±0.98 | 1.404 | ＜0.01 | 12.83±1.83 | 7.17±1.17 | 1.445 | ＜0.01 |
| 注：BUN为尿素氮；NGAL为中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白；CAT为过氧化氢酶；SOD为超氧化物歧化酶；MDA为丙二醛 | ||||||||||||||||
RTS组，T0、T1及T2时点肾小球形态大体正常；T3时点发现肾小囊内出现少量变性脱落坏死细胞。DHS组，T0时点肾小球形态大致正常；T1时点肾小管上皮细胞轻度水肿；T2时点发现肾小囊内有变性脱落上皮细胞，近曲小管轻度扩张，远曲小管上皮细胞脱落；T3时点发现肾小囊扩张，内有变性脱落上皮细胞，近曲小管上皮脱落，间质水肿。
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| 图 1 光镜下观察不同时间点各组肾组织的病理变化 (HE×200) Figure 1 Pathological changes of kidney tissue in different groups at different intervals (HE×200) |
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在T0时点，DHS组与RTS组相比，Paller评分有所升高，但差异无统计学意义 (P > 0.05)，但从T1时点开始，DHS组开始明显升高，与对应时点的RTS组相比均差异有统计学意义 (P < 0.05)，见表 1。
2.4 透射电镜扫描结果RTS组T0时点电镜结果显示，胞质内线粒体密集丰富，形态良好，内质网发达，内质网内褶间隙正常；RTS组T3时点线粒体形态、数量大致正常，内质网内褶间隙略有增宽；DHS组T0时点电镜结果显示，线粒体形态大致正常、数量尚可，内质网内褶间隙略有增宽；DHS组T3时点显示，线粒体形态呈多形性，内质网内褶间隙增宽，上皮细胞膜浆膜间隙增宽，见图 2。
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| 图 2 透射电镜扫描下肾组织的形态变化 (×8 000) Figure 2 Microphotographs scanned by morphology changes in the renal tissues (×8 000) |
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在T0时点，DHS组与RTS组相比，抗氧化指标CAT和SOD均有所下降，但差异无统计学意义 (P > 0.05)，但从T1时点开始，这些指标下降明显，差异有统计学意义 (P < 0.05)。而MDA也从T1时点开始升高，与RTS组相比差异有统计学意义 (P < 0.05)。NGAL与MDA的相关性分析，发现RTS组和DHS组NGAL水平与MDA水平均成正相关 (r常温=0.935，r干热=0.858，P < 0.01)。相关性分析见图 3，氧化应激指标见表 1。
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| A:DHS组；B:RTS组 图 3 NGAL和MDA的相关性分析 Figure 3 The correlation analysis between NGAL and MDA |
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在T0时点，与RTS组Caspase3蛋白表达 (0.053±0.014) 相比，DHS组 (0.070±0.018) 稍有增高，但差异无统计学意义 (P > 0.05)；但T3时点 (RTS组：0.175±0.036；DHS组：0.365±0.068) 差异有统计学意义 (P < 0.01), 见图 4。
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| 与RTS组比较，aP < 0.01 图 4 肾组织Casepase-3蛋白表达的比较 Figure 4 The comparison of caspase-3 protein expression in kidney tissue |
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肾脏作为高灌注器官，对缺血极为敏感，当创伤失血性休克发生时，肾内血流重新分布并转向髓质，导致肾小管和集合管处于低灌注状态；同时创伤失血性休克发生会导致氧代谢失衡、组织氧供下降，氧债累积增加[3]。在上述情况下，肾脏细胞内的线粒体极易因细胞缺血、缺氧而导致线粒体功能障碍，活性氧 (ROS) 大量爆发[9]，导致细胞凋亡的发生[10]，致使肾脏功能和器质性发生病变，引起急性肾损伤。据报道，肾脏缺血、缺氧是导致急性肾损伤的重要因素。
本研究发现，在干热环境中暴露3 h后 (T0)，BUN、肌酐、NGAL等评价肾损伤的指标便升高，但与常温组 (T0) 相比差异无统计学意义 (P > 0.05)。当干热环境合并创伤失血性休克发生后，随着时间延长肾损伤指标升高明显，NGAL在T1时点便与常温休克组差异有统计学意义 (P < 0.05)，而BUN及肌酐在T2时点才出现差异；另外肾组织病理学显示肾小囊有变性坏死脱落细胞，肾小管上皮细胞脱落，间质水肿。透射电镜结果发现随着干热环境暴露时间的延长，线粒体出现形态多形性，内质网内褶间隙增宽，上皮细胞膜浆膜间隙增宽。这些形态学表现以T3时点DHS组最为明显。
以上均可以说明当干热环境合并创伤失血性休克发生后，干热环境加速了肾功能的恶化，导致脏器损伤。有研究发现BUN及肌酐是临床上评价肾脏功能常用的指标，但是它不能评价早期肾功能情况。比如当肾小球滤过率下降50%左右，血肌酐才有所改变[11]，同时它的变化也受很多因素的影响。尿NGAL是评价早期肾损伤的指标之一，它主要反映肾小管功能状态。在肾功能正常的情况下，它处于低表达状态，当肾小管内皮细胞受到刺激后 (如缺血、药物) 才大量表达[12]。
本研究发现，与RTS组相比，T0时点DHS组CAT及SOD数量下降及MDA水平升高，但差异无统计学意义，从T1时点它们与常温休克组相比差异均具有统计学意义 (P < 0.05)。研究发现，CAT和SOD是机体主要清除活性氧 (ROS) 的酶，体内常见的抗氧化指标，当体内ROS增多后，一方面可以降低抗氧化酶的含量；另一方面可以攻击抗氧化酶，导致其活性下降[13]。同时SOD活性下降可引发脂质过氧化物产生MDA。这表明从T0时点开始，干热实验组机体抗氧化酶含量便开始下降，脂质过氧化能力开始增加。Paller等[8]研究发现，当肾脏缺血后ROS会大量产生，它可以导致肾组织损伤进行性加重。因而本研究进行了NGAL与MDA的相关性分析，发现RTS组和DHS组NGAL的表达量与MDA的表达量均成正相关 (r常温=0.935，r干热=0.858，P < 0.01)，因而笔者推测ROS产生引起的细胞膜脂质过氧化可能是导致干热环境创伤失血性休克继发性肾损伤的重要机制之一。
同时，ROS是细胞呼吸和线粒体内电子传递过程中产生的，在正常情况下可通过调节机体的抗氧化系统而发挥生物学作用。但在病理情况下 (如休克、缺血等) 因诱导性一氧化氮合酶 (iNOS) 基因表达上调，它会产生很强的氧化作用，使细胞膜脂质过氧化[14]，导致细胞膜通透性增加，其中线粒体膜过氧化也是其作用靶点。线粒体膜脂质过氧化后，导致线粒体膜通透性转化孔 (MPTP) 开放[15]、线粒体膜电位下降[16]。而MPTP的开放又会促进线粒体内ROS的过度生成，这种瀑布级联反应又加重了细胞损伤。当MPTP开放后，促凋亡蛋白如细胞色素C (Cyto-C)[17]便从线粒体内释放出来，激活Caspase蛋白[18-19]导致细胞凋亡。Caspase-3是最主要的效应蛋白[20]，它是线粒体通路通过细胞应激反应 (如：氧化应激) 导致Caspase-9激活而发生的。
本实验通过蛋白印迹分析发现，在T0时点，Caspase-3蛋白表达含量所有增高，但与常温组相比差异无统计学意义 (P > 0.05)，而在T1时点与RTS组相比，DHS组Caspase-3蛋白表达量显著增加 (P < 0.05)，提示干热环境并发创伤失血性休克时，肾脏组织的细胞凋亡亦可是导致干热环境创伤失血性休克继发性肾损伤的重要机制。综上所述，当干热环境合并创伤失血性休克时，干热环境可加重肾脏的损伤，可能是通过降低肾组织抗氧化酶含量和提高肾组织Caspase-3活性来促进肾组织细胞凋亡，因而推测氧化应激及细胞凋亡在干热环境合并创伤失血性休克中起重要作用。本实验提示临床上救治此类患者时，抗氧化应激及细胞凋亡可能是救治沙漠干热环境创伤失血性休克继发性肾损伤的重要靶点。
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