脑卒中是临床极为常见的急危重症，具有高发病率、高致死率以及高致残率的特点，其中缺血性脑卒中 (ischaemic stroke) 占了70%以上，在其发病过程中往往伴有再灌注的损伤，缺血-再灌注的损伤可引起脑梗死以及脑水肿甚至颅高压、脑疝^[2]。然而早期的研究发现，在动物试验中缺血-再灌注大鼠脑早期注射人血白蛋白有显著减小梗死灶，减轻脑水肿，提高神经功能评分等功效^[3]，但缺乏令人信服的关于机制方面的研究。近年来一项关于大剂量白蛋白在缺血性脑卒中患者中应用的大规模多临床中心的RCT研究提示早期应用白蛋白对于缺血性脑卒中患者无效，安慰剂组的相关评分甚至要优于白蛋白组^[4]。由于大规模多临床中心研究结果与部分基础研究结果存在着较大的差异^[5]，本研究通过制作MCAO大鼠模型注射白蛋白以及生理盐水在不同时间点评价血脑屏障通透性受损的严重程度，探讨人血白蛋白对缺血-再灌注大鼠血脑屏障通透性的影响及其可能机制，从而对白蛋白在缺血性脑卒中早期应用的合理性评估提供一定的理论依据。

雄性SD大鼠72只，体质量 (223±18) g[许可证号：SCXK (粤)2011-0015]由南方医科大学动物实验中心提供。

25%人血白蛋白 (GRIFOLS，奥地利)，大鼠MCAO线栓 (北京西浓科技有限公司)，AQP4抗体 (Milipore，美国)，二抗 (cellsignaling technology，美国)，伊文氏蓝染料 (Sigma，中国)，甲酰胺 (Sigma，中国)，S100B ELISA试剂盒 (Eiaab，中国)；手术显微镜 (Leica，德国)；酶标仪 (Thermos，德国)；超低温冰箱 (Panasonic，日本)；高速低温台式离心机 (BECKMAN COULTER，美国)；恒温水浴箱 (HWT-10C，中国)

SD大鼠于中山大学医学实验动物中心屏障环境饲养，室温 (23±3)℃，相对湿度保持在 (57±11)%，自由进食进水，术前12 h禁食，但可自由饮水。健康的雄性SD大鼠随机 (随机数字法) 分为6组 (n=6)。白蛋白组 (Alb组) 采用大鼠中动脉线栓栓塞 (MACO) 法，10%水合氯醛 (chloralhydrate) 麻醉，注射剂量为 (3 ml/kg)，颈部正中切口，依次分离皮肤以及肌肉，暴露出右颈总动脉以及其分支颈内动脉和颈外动脉，小心分离出与颈总动脉伴行的迷走神经，结扎颈总动脉以及颈外动脉近心端，颈内动脉打活结，于右颈总动脉的远心端剪开一小口，插入线栓打开颈内动脉活结，将线栓由右颈总动脉送入经颈内动脉进入大脑中动脉，2 h后拔出线栓，线栓拔出后经尾静脉分别予以注射25%白蛋白 (1.25 g/kg)，生理盐水组 (NS组)：方法同上，造模后经尾静脉给与生理盐水假手术组 (5 ml/kg)。假手术组 (Sham组)：充分麻醉后颈正中切口，分离出颈外动脉，颈内动脉，颈总动脉但不结扎，30 min后关闭切口。每组分为6 h，24 h两个时间点。

分别于再灌6 h以及再灌24 h两个时间点，深度麻醉后自腹主动脉取血约5 ml备用；随后采用脊柱脱臼法处死大鼠，取大鼠大脑皮层缺血半暗带置于液氮保存备用。用同样的方法制作模型以及分组，注射伊文氏蓝溶液2 h后用生理盐水灌注取脑组织备用。

实验动物处死后立即放入-20℃冰箱密封袋内，由实验室专人进行统一处理。

Zea-Longa评分标准^[6]：0分，无神经缺损症状；1分，不能完全伸展对侧前肢；2分，行走时身体向偏瘫侧转圈；3分，行走时身体向偏瘫侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。分别于造模前，再灌注0 h，6 h，24 h进行神经功能缺陷评分。

实验大鼠于再灌注6 h以及24 h接受完神经功能评分后后由腹主动脉采集动脉血5 ml，室温静置1 h，20℃，4 500 r/min离心10 min后取血清，用酶联免疫分析法 (ELISA) 测定血清中S100B含量，采用双抗体夹心法测定，S100B的标准曲线为y=402.26x-40.524(R²=0.9917)，如图 1所示。

图 1 S100B蛋白的标准曲线 Figure 1 Standard curve of S100B

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造模后于提取脑组织前2 h每100 g大鼠注射2%伊文氏蓝溶液0.4 ml，用生理盐水于左心室-右心耳灌注直至灌注液清亮后取脑组织，吸干水分健侧以及患侧大脑分别称质量后，置于3 ml甲酰胺中45℃水浴24 h，用酶标仪测得吸光度运用回归方程求得单位脑组织中伊文氏蓝染料浓度^[7]。

采用SPSS 17.0分析，计量资料用均数±标准差 (x ±s) 表示，多组数据间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

给药6 h后Sham组神经功能缺陷评分明显低Alb组以及NS组 (P < 0.01)，但Alb组与NS组之间差异无统计学意义 (P > 0.05)；给药24 h后Sham组神经功能缺陷评分明显低Alb组以及NS组 (P < 0.01)，但Alb组与NS组之间的差异无统计学意义 (P > 0.05)，见表 1。

给药6 h后NS组以及Alb组血清S100B的含量较Sham组明显升高，差异具有统计学意义。(P < 0.01)，Alb组较NS组显著升性高，差异具有统计学意义 (P < 0.01)，而24 h时间点ALB组较NS组S100B含量也有明显升高，差异具有统计学意义。但ALB组24 h血清S100B的含量较6 h显著性降低 (P < 0.01)，同样的NS组24 h S100B的含量较6 h有显著降低。(P < 0.01)。见图 2。

与Sham 6 h组比较，aP < 0.01，与NS 6 h组比较，bP < 0.05；与Sham 24 h组比较，cP < 0.01，与NS 24 h组比较，dP < 0.05 图 2 各组大鼠给药后6 h和24 h血清S100B水平比较 Figure 2 Serum S100B concentration of each group

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Sham组6 h，24 h分别与和NS组以及ALB组6 h，24 h两个时间点脑组织中伊文氏蓝染料的含量比较有所减少，差异具有统计学意义 (P=0.000)，Sham组6 h与24 h比较差异无统计学意义 (P=0.514)。ALB组6 h较NS组6 h含量明显升高，差异具有统计学意义 (P=0.001)。同样ALB组24 h较NS组24 h含量明显升高，差异具有统计学意义 (P=0.01)。ALB组24 h的伊文氏蓝含量较6 h明显升高，NS组24 h含量较6 h同样升高明显。差异具有统计学意义 (P=0.000)。见图 3。

注：与Sham组6h比较，aP < 0.01；与NS组6 h比较，bP < 0.05；与Sham组24 h比较，cP < 0.01；与NS组24 h比较dP < 0.05 图 3 各组大鼠给药后6 h，24 h脑组织中伊文氏蓝含量的比较 Figure 3 Evans blue concentration in brain tissue of each group

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与Sham组相比，其余各组AQP4的表达明显升高，在ALB组6 h中大鼠脑组织水通道相关蛋白AQP4较NS组6 h表达明显增加，同样在ALB组24 h比NS组24 h表达增加。见图 4。

与Sham组6 h比较，aP < 0.01；与NS组6 h比较，bP < 0.01；与Sham组24 h比较，cP < 0.01；与NS组24 h比较，dP < 0.01 图 4 各组脑组织AQP4的表达 Figure 4 Expression of AQP4 in brain tissue of each group

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BBB通透性的增高与脑水肿的形成以及神经功能的恶化关系密切。缺血性脑卒中常常引起相关区域的梗死以及水肿，导致相应的神经功能障碍，严重者甚至可以引起颅高压、脑疝等严重并发症危及生命。缺血-再灌注损伤所引起梗死灶神经细胞的坏死是不可逆的，而周边缺血半暗带以及周边细胞的损伤所导致的脑水肿是可逆的，所以当脑水肿减轻相应的意识障碍、运动障碍等神经功能缺失也将得到改善。BBB通透性增高，从而使外周循环中的有害物质如炎症细胞以及活性氧、自由基进入中枢引起神经细胞的损伤是缺血-再灌注损伤极其重要的环节^[2]。

白蛋白可以增加缺血-再灌注大鼠BBB的通透性，但并未发现其有提高MCAO大鼠神经功能缺陷评分的作用。白蛋白的相对分子质量为70 000，是血浆胶体渗透压的最重要组成部分，理论上增加血浆胶体渗透压有对抗脑水肿的作用，Belayev等^[3]在基础实验中发现早期注射白蛋白可以显著减少脑梗死灶以及减轻脑水肿从而改善缺血-再灌注大鼠神经功能的作用，其作用机制可能是降低血细胞比容稀释聚集的血细胞提高局部灌注，中和氧自由基，调节星形胶质细胞的增殖与代谢^{[3, 8-10]}等，白蛋白一度被认为是一种神经保护剂，然而其结果与本研究有一定差异，本研究并未发现白蛋白有改善缺血-再灌注大鼠神经功能的作用，结果提示Alb组与NS组神经功能缺陷评分之间的差异无统计学意义，神经细胞的完整性决定相应神经功能的完整性，神经功能研究的结果说明了白蛋白减轻神经细胞损伤作用不明显，结果出现差异的原因可能与作用时间以及注射剂量等有关。有其他学者亦对白蛋白对大脑缺血-再灌注的影响进行了研究，Hatashita等^[11]用干湿比重法研究发现与生理盐水比较注射白蛋白对缺血-再灌注引起的脑含水量变化没有明显差异。研究发现白蛋白可透过损伤的血脑屏障，提高局部胶体渗透压，可能引起局部脑水肿加剧^[12-13]。Simpson等^[14]以及Eberhardt等^[15]的研究发现当BBB破坏，白蛋白进入脑组织中表现出神经毒性的作用。2011年美国主导了一项在缺血性脑卒中患者中早期使用大剂量白蛋白的大规模多临床中心的试验，结果提示缺血性脑卒中患者早期应用白蛋白无效，安慰剂生理盐水组的预后甚至优于白蛋白组^[4]，以上这些研究的结果与本研究较一致：白蛋白减轻缺血-再灌注损伤的作用不明显，甚至有加剧脑水肿的趋势。本实验通过研究BBB通透性相关指标的变化来检测白蛋白对于缺血-再灌注的影响。S100B蛋白主要由星形胶质细胞合成与分泌，当BBB遭到破坏，星形胶质细胞凋亡或坏死外周血中的S100B会相应的升高^[16]，结果提示6 h的Alb组外周血中S100B蛋白的含量要高于NS组，同样24 h Alb组的含量要高于NS组，但是24 h Alb组，NS组较6 h组外周血中S100B蛋白的含量整体是呈下降趋势，结果提示白蛋白可能有加重神经细胞损伤或增加BBB通透性等负面作用，至于S100B随着时间的延长血清含量呈下降趋势考虑其原因可能为S100B蛋白的半衰期短，细胞表达或者释放有限等因素有关^[16]。本研究进一步利用伊文氏蓝定量法检测BBB通透性发现ALB组6 h，24 h脑组织伊文氏蓝的含量均要高于NS组，说明了在缺血-再灌注早期应用白蛋白增加了BBB的通透性。

白蛋白上调脑组织中AQP4的表达可能是导致缺血-再灌注大鼠BBB通透性增加的原因之一。水通道蛋白AQP4主要表达在中枢神经系统的星形胶质细胞，与脑水肿的发生密切相关^[17]，然而BBB通透性的增加直接作用就是引起相关区域的神经细胞水肿，本研究发现在6 h、24 h，ALB组以及NS组脑组织AQP4较Sham组的表达均有增加，两个时间点Alb组的表达均要高于NS组，说明注射白蛋白后引起脑组织AQP4的表达增高可能是其增加BBB通透性和脑损伤的机制之一。本实验结果提示白蛋白在缺血-再灌注早期应用并没有改善神经功能的作用反而可能通过增加BBB通透性造成神经细胞损伤、脑水肿加剧，其作用机制可能与水通道蛋白AQP4上调有关。