中华急诊医学杂志  2017, Vol. 26 Issue (4): 392-395
姜黄素对百草枯中毒致肺纤维化大鼠肺功能及TGF-β1、NF-κB表达的影响
唐艳, 杨蓉佳, 陈红纲, 付晓燕, 许筠, 冯友繁, 刘世杰, 张世魁, 候丽君     
730046 兰州,兰州市第二人民医院急诊科 (唐艳、许筠、刘世杰、候丽君);730000 兰州,甘肃省人民医院急诊科 (杨蓉佳、陈红纲、冯友繁、张世魁);730000 兰州,兰州大学第一医院门诊部 (付晓燕)
摘要: 目的 观察姜黄素对百草枯中毒致肺纤维化大鼠肺功能及TGF-β1、NF-κB的影响,为其临床应用提供理论依据。 方法 SPF级Wistar大鼠72只随机 (随机数字法) 分为百草枯染毒组 (百草枯50 mg/kg一次性灌胃染毒)、姜黄素治疗组 (百草枯染毒后30 min给予姜黄素200 mg/kg一次性腹腔内注射),空白对照组 (相同时间点注射等体积生理盐水)。常规饲养14 d后观察大鼠肺功能,免疫组化法检测转化生长因子-β1(TGF-β1)、核因子-κB (NF-κB) 蛋白的表达。 结果 姜黄素干预组动物生存率41.67%,百草枯中毒组生存率70.83%,两组比较差异具有统计学意义 (P < 0.05)。与空白对照组相比,百草枯染毒组TE (呼气时间)、PIF (吸气峰流量)、PEF (呼气峰流量)、EF50(呼出50%气量时的流速)、TV (潮气量)、F (呼吸频率) 等肺功能指标均下降,差异具有统计学意义 (P < 0.05或P < 0.01),与百草枯染毒组比较,姜黄素治疗组Te、PEF、TV、F均升高,差异具有统计学意义 (P < 0.05或P < 0.01);大鼠肺组织中TGF-β1、NF-κB在空白对照组有少量表达,与空白对照组比,百草枯染毒组表达明显增强 (P < 0.01或P < 0.05);姜黄素治疗组与百草枯染毒组比较,TGF-β1、NF-κB表达显著减弱 (P < 0.01或P < 0.05); 结论 抑制肺组织中TGF-β1、NF-κB的过度表达,是姜黄素减轻百草枯中毒肺纤维化程度的作用机制之一。
关键词: 百草枯     肺纤维化     姜黄素     肺功能     转化生长因子-β1     核因子-κB    
Effects of curcumin on pulmonary functions and the expression of TGF-β1
and NF-κB of paraquat-induced pulmonary fibrosis of rats
Tang Yan, Yang Rongjia, Chen Honggang, Fu Xiaoyan, Xu Jun, Feng Youfan, Liu Shijie, Zhang Shikui, Hou Lijun     
Emergency Department, The Second People' s Hospital of Lanzhou, Lanzhou 730046, China (Tang Y, Xu J, Liu SJ, HouLJ); Emergency Department, The Gansu Province People' s Hospital, Lanzhou 730000, China (Yang RJ, Chen HG, Feng YF, Zhang SK); Out-patient Department, The First Affiliated Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China (Fu XY)
Corresponding author: YangRongjia, Email:13909447906@163.com
Abstract: Objective To discuss the effects and the possible mechanismof curcumin on pulmonary functions and expression of TGF-β1 and NF-κB in paraquat-induced pulmonary fibrosis of rats. Methods SPF Wistar rats were randomly (random number) divided into three groups: paraquat-poisoned group (PQ group, with PQ 50 mg/kg by gavage), Curcumin-treatment group (PC group after 30, with curcumin (200 mg/kg) by intraperitoneal injection), and Blank group (B group, with same volume of sterile saline at the same time). After 14 d, the lung function of rats was observed, and the expression of TGF-β1 and NF-κB protein were detected by immunohistochemistry. Results The survival rates of mice significant difference in the PC and PQ groups with (70.83% vs.41.67%, P < 0.05). Compared with the B group, lung function index (Te, PIF, PEF, EF50, TV, F) of PQ group significantly decreased (P < 0.05, P < 0.01).Compared with the PQ group, lung function index (Te, PEF, TV, F) of PC group significantly increased (P < 0.05 or P < 0.01).There are some expression of lung tissues of rats with TGF-β1, NF-κB in B group.Compared with B group, PQ group significantly enhanced (P < 0.01or P < 0.05). Compared with the PQ, PC group significantly decreased (P < 0.01 or P < 0.05). Conclusions Curcumin can relieve paraquat-induced pulmonary fibrosis by inhibiting the over expression of TGF-β1, NF-κB in lung tissue of rats.
Key words: Paraquat     Pulmonary fibrosis     Curcumin     Pulmonary functions     TGF-β1     NF-κB懂    

百草枯 (paraquat) 是目前广泛使用的除草剂。对人畜毒性较强,可以引起肝、肾、肺等主要脏器损害。其中肺组织纤维化损害最为严重,并呈现进行性发展过程[1]。百草枯对人体损害极大,文献报道急性中毒病死率高达75%~80%[2],但目前缺乏特效解毒剂以及有效治疗手段。大剂量百草枯中毒者可在短期内出现多脏器功能障碍伴微循环障碍,是百草枯中毒患者早期死亡的主要原因,若能度过急性期,患者晚期多死于肺间质纤维化所致的呼吸衰竭[3-5]

姜黄素 (curcumin) 是从中药姜黄中提取的一种酚性色素,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用,近期的研究发现它抗纤维化作用明显[6]。本实验研究应用WPB PLT-UNR-RT-2型动物肺功能检测系统检测百草枯致肺纤维化大鼠肺功能,同时应用免疫组化法检测肺组织中TGF-β1、NF-κB表达水平,初步探讨姜黄素抗肺纤维化的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物分组

72只SPF级Wistar大鼠,雌雄各半,体质量 (200±20) g,甘肃中医药大学科研实验中心提供,动物质量合格证号:62001000000165;许可证号:SCXK (甘)2011-0001。各组大鼠适应性喂养3 d,随机 (随机数字表法) 分为空白对照组,百草枯染毒组,姜黄素治疗组,每组24只。

1.2 模型制备及给药

百草枯染毒组及姜黄素治疗组给予百草枯 (50 mg/kg)(北京华都生物科技) 一次性灌胃染毒复制百草枯中毒模型之后,空白对照组大鼠给予蒸馏水灌胃;灌胃30 min后,姜黄素治疗组给予姜黄素 (Sigma公司)200 mg/kg一次性腹腔注射,空白对照组、百草枯染毒组注射等体积生理盐水。常规饲养14 d。

1.3 肺功能检测

实验第14天,运用WPB PLT-UNR-RT-2型动物肺功能检测系统 (法国EMKA公司) 检测各组大鼠肺功能,启动IOX数据采集系统软件,调试设备,确保系统处于正常工作状态。将大鼠分批放入动物体积描记箱中,等动物安静后,记录肺功能数据,包括TI (吸气时间)、TE (呼气时间)、PIF (吸气峰流量)、PEF (呼气峰流量)、EF50(呼出50%气量时的流速)、TV (潮气量)、F (呼吸频率),统计数据。

1.4 TGF-β1、NF-κB表达的测定

各组大鼠于肺功能实验结束后,处死大鼠,剪开胸腔,小心分离肺组织,取右肺组织制备病理切片后免疫组化法检测TGF-β1、NF-κB (北京博奥森生物技术有限公司) 的表达。蛋白表达阳性结果的判定标准:细胞中未出现棕黄色颗粒,则表达视为阴性。细胞内出现棕黄色颗粒,颜色越深表达越强。在图像分析系统 (CX21型生物显微镜,日本OLYMPUS公司;Mi E图像处理系统,山东易创电子有限公司;BI-2000医学图像分析系统,成都泰盟科技有限公司) 20倍物镜下,每张切片从四周和中间随机选取5个视野,测定肺组织内TGF-β1及NF-κB表达颗粒的积分吸光度,取其平均值作为该只大鼠的肺组织TGF-β1、NF-κB蛋白表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行分析,计量数据用均数±标准差 (x ±s) 表示,组间比较行方差分析,以P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 实验动物一般情况观察结果

PQ组动物在一次性灌胃染毒后30 min至4 h逐渐出现中毒反应,出现呼吸急促、进食进量减少或不进食水、精神反应差、行为灵敏度降低、行动协调性差、攻击性低、少动、毛蓬松、毛色污秽、鼠尾发绀、口鼻可见血性分泌物、腹泻等表现。中毒表现以1~7 d最明显。实验动物均出现体质量下降或不增,甚至部分动物在1~14 d可闻及较明显的干湿啰音。PC组动物染毒后中毒反应较PQ组明显减轻,进食水较正常,体质量下降不明显,未见腹泻及口鼻出血,精神好,反应较灵敏,毛色较洁净,较少出现呼吸急促、鼠尾发绀等表现。

2.2 动物的生存率差异

14 d后,PQ组动物生存率为41.67%,PC组生存率为70.83%,经χ2检验两组生存率的差异具有统计学意义 (P < 0.05)。

2.3 肺功能测定

与空白对照组相比,百草枯染毒组Te、PIF、PEF、EF50、TV、F等肺功能指标均下降,差异具有统计学意义 (P < 0.05,P < 0.01),Ti指标变化不明显 (P﹥0.05)。与百草枯染毒组比较,姜黄素治疗组的Te、PEF、TV、F均升高,差异具有统计学意义 (P < 0.05,P < 0.01),Ti、PIF、EF50指标变化不明显 (P﹥0.05),见表 1

表 1 姜黄素对肺纤维化大鼠肺功能的影响 (x ±s) Table 1 Effect of curcumin on respiratory function of pulmonary fibrosis in rats (x ±s)
组别 n Ti (ms) Te (ms) PIF (mL/s) PEF (mL/s) EF50(mL/s) TV (mL) F (次/min)
空白对照组 24 103.32±21.67 149.21±23.38 61.49±12.83 78.45±21.66 29.77±11.03 2.81±0.47 132.56±31.21
百草枯染毒组 10 99.54±19.80 115.73±21.55a 38.37±15.28b 51.76±18.32a 12.43±9. 87b 1.52±0.33b 186.45±24.34a
姜黄素治疗组 17 97.62±15.44 138.89±34.51c 37.23±13.66d 65.39±21.12c 14.87±10.81d 2.34±0.19c 145.99±20.17d
注:与空白组比较,aP < 0.05,bP < 0.01;与模型组比较,cP < 0.05,dP < 0.01
2.4 TGF-β1蛋白含量的测定

镜下显示,空白对照组大鼠少数细支气管黏膜上皮细胞的胞浆可见TGF-β1蛋白少量表达;百草枯染毒组大鼠肺泡巨噬细胞、浸润的炎细胞、内皮细胞及肺泡上皮细胞均有TGF-β1表达,与空白对照组比较明显增强 (P < 0.01);姜黄素治疗组与百草枯染毒组比较,TGF-β1表达显著减弱 (P < 0.01);见图 1表 2

图 1 各组大鼠肺组织TGF-β1蛋白表达的免疫组化 (SABC×400) Figure 1 The expression of TGF-β1 in the lung of rats detected by immunohistochemistry (SABC×400)
表 2 各组大鼠肺组织TGF-β1、NF-κB的平均吸光度值 (x ±s) Table 2 MOD of TGF-β1、NF-κB in the lung of rats (x ±s)
组别 n TGF-β1(MOD值) NF-κB (MOD值)
空白对照组 12 4.15±0.52 0.54±0.06
百草枯染毒组 9 29.72±4.27b 1.35±0.04a
姜黄素治疗组 10 15.46±2.89d 0.78±0.06c
注:与空白组比较,aP < 0.05,bP < 0.01;与模型组比较,cP < 0.05,dP < 0.01
2.5 NF-κB蛋白含量的测定

空白对照组大鼠肺组织中仅有少数细胞胞浆被染成浅黄色,而模型组大鼠肺组织细胞的阳性表达呈棕黄色,支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞及肺间质中均有表达,与空白对照组比较表达明显增强 (P < 0.05);姜黄素治疗组与百草枯染毒组比较,NF-κB表达显著减弱 (P < 0.05);见图 2表 2

图 2 各组大鼠肺组织NF-κB蛋白表达的免疫组化 (SABC×400) Figure 2 The expression of NF-κB in the lung of rats detected by immunohistochemistry (SABC×400)
3 讨论

百草枯中毒的主要靶器官是肺脏,中毒特征改变是急性肺损伤,主要是由于Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞早期的破坏和肺泡炎、肺水肿、炎症细胞浸润所致,并最终引起肺纤维化[7]。肺纤维化是细胞外基质的过度沉积的过程,涉及到细胞、细胞因子、细胞外基质等因素间的相互作用。是多种因素、多个环节参与的缓慢的错综复杂的过程[8]。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) 可以诱导胶原合成和基质改变,在多种类型的肺间质纤维化中具有关键作用[9-10]。研究表明,在肺间质纤维化过程中,完全分化的上皮细胞在TGF-β1作用下,可发生表型改变,转化成为成纤维细胞和肌成纤维细胞。在PQ中毒肺纤维化发生过程中,TGF-β1能显著增加ECM的合成,减少其降解,从而破坏ECM合成降解的动态平衡,最终导致肺纤维化的形成[11]。NF-κB是调控炎症反应的重要核转录因子,可在多种细胞中被激活,通过调节多种前炎性因子/趋化因子、粘附分子、生长因子的表达,在应激反应、炎症和免疫反应等过程中发挥重要甚至中心作用[12]。是参与急性肺损伤和肺纤维化的重要因子[13]。姜黄素是从姜科姜黄属植物的根茎中提取的一种植物多酚。众多动物实验表明,它有广泛的药理作用如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血脂等。Singh等[14]已证实姜黄素是NF-κB活化的高效抑制剂,通过抑制NF-κB在多种急、慢性炎症疾病中发挥重要作用[15-16]

本实验检测的肺功能指标主要包括呼吸时间、呼吸速度指标、肺容量指标及呼吸频率等。上述指标可判断肺间质纤维化疾病中气道通畅性、通气功能、肺组织弹性和储存能力。实验结果表明,百草枯染毒组Te、PIF、PEF、EF50、TV、F等肺功能指标均下降,说明肺纤维化发生过程中,大鼠的整体肺功能明显减弱。大鼠肺组织中TGF-β1、NF-κB在空白对照组有少量表达,与空白对照组比,百草枯染毒组表达明显增强,说明TGF-β1、NF-κB均参与了百草枯中毒致肺纤维化的形成,姜黄素治疗组的Te、PEF、TV、F均升高,对大鼠肺的呼吸时间、呼吸速度指标、肺容量指标及呼吸频率等均有不同程度的改善作用;姜黄素治疗组的TGF-β1、NF-κB蛋白与百草枯染毒组比较,含量亦显著减少。

综上所述,抑制核因子κB活性,减少TGF-β1蛋白表达,使炎症及纤维化病变减轻,是姜黄素治疗百草枯中毒致肺纤维化的机制之一。

参考文献
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