and NF-κB of paraquat-induced pulmonary fibrosis of rats
百草枯 (paraquat) 是目前广泛使用的除草剂。对人畜毒性较强,可以引起肝、肾、肺等主要脏器损害。其中肺组织纤维化损害最为严重,并呈现进行性发展过程[1]。百草枯对人体损害极大,文献报道急性中毒病死率高达75%~80%[2],但目前缺乏特效解毒剂以及有效治疗手段。大剂量百草枯中毒者可在短期内出现多脏器功能障碍伴微循环障碍,是百草枯中毒患者早期死亡的主要原因,若能度过急性期,患者晚期多死于肺间质纤维化所致的呼吸衰竭[3-5]。
姜黄素 (curcumin) 是从中药姜黄中提取的一种酚性色素,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用,近期的研究发现它抗纤维化作用明显[6]。本实验研究应用WPB PLT-UNR-RT-2型动物肺功能检测系统检测百草枯致肺纤维化大鼠肺功能,同时应用免疫组化法检测肺组织中TGF-β1、NF-κB表达水平,初步探讨姜黄素抗肺纤维化的作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物分组72只SPF级Wistar大鼠,雌雄各半,体质量 (200±20) g,甘肃中医药大学科研实验中心提供,动物质量合格证号:62001000000165;许可证号:SCXK (甘)2011-0001。各组大鼠适应性喂养3 d,随机 (随机数字表法) 分为空白对照组,百草枯染毒组,姜黄素治疗组,每组24只。
1.2 模型制备及给药百草枯染毒组及姜黄素治疗组给予百草枯 (50 mg/kg)(北京华都生物科技) 一次性灌胃染毒复制百草枯中毒模型之后,空白对照组大鼠给予蒸馏水灌胃;灌胃30 min后,姜黄素治疗组给予姜黄素 (Sigma公司)200 mg/kg一次性腹腔注射,空白对照组、百草枯染毒组注射等体积生理盐水。常规饲养14 d。
1.3 肺功能检测实验第14天,运用WPB PLT-UNR-RT-2型动物肺功能检测系统 (法国EMKA公司) 检测各组大鼠肺功能,启动IOX数据采集系统软件,调试设备,确保系统处于正常工作状态。将大鼠分批放入动物体积描记箱中,等动物安静后,记录肺功能数据,包括TI (吸气时间)、TE (呼气时间)、PIF (吸气峰流量)、PEF (呼气峰流量)、EF50(呼出50%气量时的流速)、TV (潮气量)、F (呼吸频率),统计数据。
1.4 TGF-β1、NF-κB表达的测定各组大鼠于肺功能实验结束后,处死大鼠,剪开胸腔,小心分离肺组织,取右肺组织制备病理切片后免疫组化法检测TGF-β1、NF-κB (北京博奥森生物技术有限公司) 的表达。蛋白表达阳性结果的判定标准:细胞中未出现棕黄色颗粒,则表达视为阴性。细胞内出现棕黄色颗粒,颜色越深表达越强。在图像分析系统 (CX21型生物显微镜,日本OLYMPUS公司;Mi E图像处理系统,山东易创电子有限公司;BI-2000医学图像分析系统,成都泰盟科技有限公司) 20倍物镜下,每张切片从四周和中间随机选取5个视野,测定肺组织内TGF-β1及NF-κB表达颗粒的积分吸光度,取其平均值作为该只大鼠的肺组织TGF-β1、NF-κB蛋白表达量。
1.5 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行分析,计量数据用均数±标准差 (x ±s) 表示,组间比较行方差分析,以P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 实验动物一般情况观察结果PQ组动物在一次性灌胃染毒后30 min至4 h逐渐出现中毒反应,出现呼吸急促、进食进量减少或不进食水、精神反应差、行为灵敏度降低、行动协调性差、攻击性低、少动、毛蓬松、毛色污秽、鼠尾发绀、口鼻可见血性分泌物、腹泻等表现。中毒表现以1~7 d最明显。实验动物均出现体质量下降或不增,甚至部分动物在1~14 d可闻及较明显的干湿啰音。PC组动物染毒后中毒反应较PQ组明显减轻,进食水较正常,体质量下降不明显,未见腹泻及口鼻出血,精神好,反应较灵敏,毛色较洁净,较少出现呼吸急促、鼠尾发绀等表现。
2.2 动物的生存率差异14 d后,PQ组动物生存率为41.67%,PC组生存率为70.83%,经χ2检验两组生存率的差异具有统计学意义 (P < 0.05)。
2.3 肺功能测定与空白对照组相比,百草枯染毒组Te、PIF、PEF、EF50、TV、F等肺功能指标均下降,差异具有统计学意义 (P < 0.05,P < 0.01),Ti指标变化不明显 (P﹥0.05)。与百草枯染毒组比较,姜黄素治疗组的Te、PEF、TV、F均升高,差异具有统计学意义 (P < 0.05,P < 0.01),Ti、PIF、EF50指标变化不明显 (P﹥0.05),见表 1。
组别 | n | Ti (ms) | Te (ms) | PIF (mL/s) | PEF (mL/s) | EF50(mL/s) | TV (mL) | F (次/min) |
空白对照组 | 24 | 103.32±21.67 | 149.21±23.38 | 61.49±12.83 | 78.45±21.66 | 29.77±11.03 | 2.81±0.47 | 132.56±31.21 |
百草枯染毒组 | 10 | 99.54±19.80 | 115.73±21.55a | 38.37±15.28b | 51.76±18.32a | 12.43±9. 87b | 1.52±0.33b | 186.45±24.34a |
姜黄素治疗组 | 17 | 97.62±15.44 | 138.89±34.51c | 37.23±13.66d | 65.39±21.12c | 14.87±10.81d | 2.34±0.19c | 145.99±20.17d |
注:与空白组比较,aP < 0.05,bP < 0.01;与模型组比较,cP < 0.05,dP < 0.01 |
镜下显示,空白对照组大鼠少数细支气管黏膜上皮细胞的胞浆可见TGF-β1蛋白少量表达;百草枯染毒组大鼠肺泡巨噬细胞、浸润的炎细胞、内皮细胞及肺泡上皮细胞均有TGF-β1表达,与空白对照组比较明显增强 (P < 0.01);姜黄素治疗组与百草枯染毒组比较,TGF-β1表达显著减弱 (P < 0.01);见图 1,表 2。
组别 | n | TGF-β1(MOD值) | NF-κB (MOD值) |
空白对照组 | 12 | 4.15±0.52 | 0.54±0.06 |
百草枯染毒组 | 9 | 29.72±4.27b | 1.35±0.04a |
姜黄素治疗组 | 10 | 15.46±2.89d | 0.78±0.06c |
注:与空白组比较,aP < 0.05,bP < 0.01;与模型组比较,cP < 0.05,dP < 0.01 |
空白对照组大鼠肺组织中仅有少数细胞胞浆被染成浅黄色,而模型组大鼠肺组织细胞的阳性表达呈棕黄色,支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞及肺间质中均有表达,与空白对照组比较表达明显增强 (P < 0.05);姜黄素治疗组与百草枯染毒组比较,NF-κB表达显著减弱 (P < 0.05);见图 2,表 2。
3 讨论百草枯中毒的主要靶器官是肺脏,中毒特征改变是急性肺损伤,主要是由于Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞早期的破坏和肺泡炎、肺水肿、炎症细胞浸润所致,并最终引起肺纤维化[7]。肺纤维化是细胞外基质的过度沉积的过程,涉及到细胞、细胞因子、细胞外基质等因素间的相互作用。是多种因素、多个环节参与的缓慢的错综复杂的过程[8]。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) 可以诱导胶原合成和基质改变,在多种类型的肺间质纤维化中具有关键作用[9-10]。研究表明,在肺间质纤维化过程中,完全分化的上皮细胞在TGF-β1作用下,可发生表型改变,转化成为成纤维细胞和肌成纤维细胞。在PQ中毒肺纤维化发生过程中,TGF-β1能显著增加ECM的合成,减少其降解,从而破坏ECM合成降解的动态平衡,最终导致肺纤维化的形成[11]。NF-κB是调控炎症反应的重要核转录因子,可在多种细胞中被激活,通过调节多种前炎性因子/趋化因子、粘附分子、生长因子的表达,在应激反应、炎症和免疫反应等过程中发挥重要甚至中心作用[12]。是参与急性肺损伤和肺纤维化的重要因子[13]。姜黄素是从姜科姜黄属植物的根茎中提取的一种植物多酚。众多动物实验表明,它有广泛的药理作用如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血脂等。Singh等[14]已证实姜黄素是NF-κB活化的高效抑制剂,通过抑制NF-κB在多种急、慢性炎症疾病中发挥重要作用[15-16]。
本实验检测的肺功能指标主要包括呼吸时间、呼吸速度指标、肺容量指标及呼吸频率等。上述指标可判断肺间质纤维化疾病中气道通畅性、通气功能、肺组织弹性和储存能力。实验结果表明,百草枯染毒组Te、PIF、PEF、EF50、TV、F等肺功能指标均下降,说明肺纤维化发生过程中,大鼠的整体肺功能明显减弱。大鼠肺组织中TGF-β1、NF-κB在空白对照组有少量表达,与空白对照组比,百草枯染毒组表达明显增强,说明TGF-β1、NF-κB均参与了百草枯中毒致肺纤维化的形成,姜黄素治疗组的Te、PEF、TV、F均升高,对大鼠肺的呼吸时间、呼吸速度指标、肺容量指标及呼吸频率等均有不同程度的改善作用;姜黄素治疗组的TGF-β1、NF-κB蛋白与百草枯染毒组比较,含量亦显著减少。
综上所述,抑制核因子κB活性,减少TGF-β1蛋白表达,使炎症及纤维化病变减轻,是姜黄素治疗百草枯中毒致肺纤维化的机制之一。
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