脓毒症 (sepsis)，是由严重感染引起的全身炎症反应综合征 (systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，可诱发脓毒症性休克、多器官功能障碍综合征 (multiple organ dysfunction syndrome, MODS)^[1-7]。肾脏是机体内最易受脓毒症影响的器官之一^[8]，研究显示轻度、中度和重症脓毒症及脓毒症休克患者急性肾损伤 (acute kidney injury, AKI) 的发生率分别为19%、23%和51%，且一旦发生急性肾损伤患者的病死率甚至可高达70%^[9-11]。目前，脓毒症时AKI的发生机制尚未被完全阐明。

Klotho蛋白最初是在1997年由韩国科学在抗衰老研究中被发现的，是体内Klotho基因编码的一种单向跨膜蛋白，主要在肾小管上皮细胞中表达，具有包括调节矿物质代谢、抗凋亡和抗衰老等多种生物学效应^[12]。近年的研究提示Klotho蛋白水平降低可能在急性肾损伤的发生发展中起着重要作用，并有可能作为AKI诊断和判断预后的一个新的标志物^[12]。

自噬 (autophagy) 是细胞利用溶酶体形成自噬溶酶体降解自身受损的细胞器 (例如线粒体) 和大分子物质的过程，是细胞生长发育、分化及死亡的重要调控机制^[13]。近年来，在AKI中，越来越多的证据表明肾缺血-再灌注诱导期和顺铂、环孢素和环境毒素等肾毒性药物在近端肾小管细胞都可诱导自噬的发生^[14-18]。

在脓毒症急性肾损伤中，Klotho与自噬又是如何表达的呢？搜索国内外文献，均没有涉及。因此，本研究选用盲肠结扎穿刺术 (CLP法) 建立小鼠脓毒症急性肾损伤动物模型，深入探讨Klotho和自噬的关系，从而进一步了解脓毒症急性肾损伤的发生机制，为后续的干预治疗提供基础。

清洁级健康雄性Balb/c小鼠96只，6~8周龄，体质量 (20±2) g，由上海斯莱克实验动物中心提供[实验动物生产许可证：SCXK (沪) 2012-0002]；在温州医科大学实验动物中心饲养[实验动物使用许可证：SYXK (浙) 2010-0150]。普通饲养，人工光照、阴暗各12 h，40%~60%的相对湿度，25 ℃恒温的普通设施中，给予标准的颗粒饲料，适应性喂养1周。

Klotho蛋白 (Abcam公司，美国)，LC3-Ⅱ、P62、β-actin、辣根过氧化物酶标记二抗 (Cell Signaling公司，美国)，3%H₂O₂、山羊血清封闭液、聚合HRP标记的二抗、DAB (北京中杉金桥有限公司，中国)。RIPA裂解液 (碧云天公司，中国)。BCA蛋白检测试剂盒 (Pierce公司，美国)。PVDF膜 (Millipore公司，美国)。ECL试剂盒 (Pierce公司，美国)。血肌酐检测试剂盒 (肌氨酸氧化酶法)(南京建成生物工程研究所，中国)、尿素氮检测试剂盒 (脲酶法)(南京建成生物工程研究所，中国)。其他均为国产分析醇。

采用清洁级健康雄性Balb/c小鼠，自由饮水，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后，行仰卧位将小鼠固定于手术板，75%酒精棉球消毒小鼠腹部手术区域三次；用眼科剪在小鼠腹部做1.0 cm纵向的正中切口，切开腹膜，暴露腹腔，使用圆钝的眼科镊游离盲肠；找出盲肠末端，用4-0手术缝线于距盲肠末端1.5~2 cm处结扎盲肠，22号针头 (黑色5号注射器针头) 在结扎处与盲肠远端的中间贯穿穿孔2次，并挤出少许的肠内容物；盲肠还纳入腹腔；常规缝合筋膜和皮肤。术毕，背部松弛皮下注射1 ml 37℃预热的无菌生理盐水复苏小鼠。假手术组只开腹、牵引盲肠、复位、关腹、复苏，但盲肠既不结扎，也不穿孔。

模型成功标准：CLP模型构建后6 h内未出现死亡，并出现包括腹泻、竖毛、萎靡、活动力减弱等实验室脓毒症的标准症状，24 h病死率达高峰，72 h病死率在40%~60%，即为造模成功。并同时观察小鼠肾脏的病理改变，明确有无AKI表现，预实验结果证实小鼠脓毒症急性肾损伤造模成功。

分别在CLP造模后3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d处死小鼠 (n=12)，假手术组1 d处死 (n=6)，正常组同时处死 (n=6)。

以1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，摘眼球取血，2 500 r/min离心10 min收集血清冻存于-80℃冰箱用于肾功能检测。腹正中切口暴露肾脏并摘除，小心去除肾包膜。将肾脏分成三部分：一部分肾组织用冰生理盐水冲洗后，切成四块迅速放入液氮中转移，之后保存于-80℃冰箱以提取蛋白做Western blot；一部分肾组织切成四块在4%多聚甲醛中固定，常规脱水石蜡包埋，待做HE、PAS染色和免疫组化，一部分肾组织于2.5%戊二醛中固定，待做电镜检查。

血肌酐采用肌氨酸氧化酶法，尿素氮采用脲酶法，按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书通过酶标仪检测。

① 取-80 ℃保存的小鼠肾皮质组织，4 ℃PBS润洗，加预冷的RIPA裂解液400 μL匀浆，充分裂解组织细胞，冰上放置30 min，超速离心 (14 000 r/min，30 min，4 ℃)，收集上清。②BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度：用蛋白标准品作出标准曲线，酶标仪测定样品吸光度，根据标准曲线得出样品的蛋白浓度，调节蛋白浓度，上样量为40 μg。③蛋白质电泳和印迹电转移：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳配置质量分数为8%、12%的分离胶和5%的浓缩胶，电泳条件：恒压，先80 V，待溴酚蓝到达分离胶后改电压为120 V，直至溴酚蓝跑到凝胶底部；电泳结束后用PVDF膜进行印迹转移。④Western印迹分析：采用质量分数为5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液室温封闭1 h，TBS-T洗膜3次后，加入一抗anti-Klotho (1: 1 000), anti-LC3-Ⅱ (1: 1 000), anti-P62 (1: 1 000)，于4 ℃孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗 (1: 2 000)，室温孵育1 h；TBS-T洗膜3次，化学发光底物ECL显色、用Image-Lab 3.0 (Bio-Rad) 软件曝光并分析灰度值。

① 光镜HE、PAS染色观察肾组织的病理变化肾组织标本从4%多聚甲醛中取出，酒精梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，常规切片 (厚度为3 μm)，梯度脱蜡，行HE和PAS染色，中性树胶封片，显微镜下观察肾组织病理变化。

② 透射电镜观察自噬体的形成取肾皮质组织切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，逐级丙酮脱水，Epon812树脂包埋，半薄切片光镜下定位肾小球后，LKB-V型超薄切片机切片，醋酸铀染色，H-7500型透射电镜观察肾脏超微结构的变化。

3 μm石蜡切片常规脱蜡水化，柠檬酸盐缓冲液 (pH 6.0) 中高压煮沸4 min修复抗原，加3% H₂O₂孵育10 min (室温)；滴加山羊血清封闭液 (室温封闭1 h)，滴加一抗：anti-Klotho (1: 100), anti-LC3-Ⅱ (1: 100)，4℃孵育过夜。加使用聚合HRP标记的二抗 (室温孵育1 h)。DAB显色 (室温，镜下控制反应时间)、蒸馏水洗涤、苏木精轻度复染。脱水、透明、封片。不滴加一抗的作为阴性对照。光学显微镜下观察，200倍视野下，每张切片随机取5个非重叠且非髓质视野，避开切片边缘区和组织破损区，采用Image Pro Plus 6.0软件测定肾组织Klotho蛋白、LC3-Ⅱ蛋白积分吸光度值 (IOD)。

用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差 (x ±s) 表示，组间差异采用独立样本资料的t检验，若方差不齐，则选近似t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

血肌酐和血尿素氮在CLP术后6 h开始明显升高，1 d时达高峰，2 d时开始下降，3 d和5 d时继续下降，逐渐降至基础浓度，表明肾功能不全在CLP术后1 d时改变最显著，而假手术组和正常组几乎无变化 (见图 1)。1 d时Scr (165.64±20.56)μmol/L与假手术组 (22.69±3.27)μmol/L相比，t=-18.077, P < 0.01, 与正常组 (18.78±2.36)μmol/L相比，t=-18.725, P < 0.01；1 d时BUN (45.51±4.05) mmol/L与假手术组 (11.24±0.88) mmol/L相比，t=-21.685, P < 0.01, 与正常组 (10.03±0.73) mmol/L相比，t=-22.667, P < 0.01。

与假手术组相比较，aP < 0.05，bP < 0.01；与正常组相比，cP < 0.05，dP < 0.01 图 1 各组小鼠CLP术后各时间点Scr和BUN的变化 Figure 1 The variation of Scr and BUN after CLP between different mice group

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CLP术后，与假手术组和正常组相比，Klotho蛋白浓度从3 h开始逐渐变淡，至1 d时达最低值，2 d时有所恢复，然后逐渐转浓。自噬相关蛋白包括LC3和P62，其变化趋势也有时间依赖性。LC3-Ⅱ从3 h开始逐渐增浓，至1 d时达峰值，2 d时有所下降，然后逐渐变淡，而P62与LC3-Ⅱ变化相反，更进一步支持自噬的激活作用，在1 d这个时间点最显著 (图 2)。

与假手术组相比较，aP < 0.01 图 2 蛋白印迹检测各组小鼠CLP术后各时间点Klotho蛋白、LC3蛋白和P62蛋白的表达 Figure 2 The expression of Klotho, LC3-Ⅱ and P62 after CLP between different mice group by Westernblotting

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Klotho蛋白与假手术组相比，1 d时t=51.851, P < 0.001；2 d时t=33.480, P < 0.01。LC3-Ⅱ与假手术组相比，1 d时t=-22.676, P < 0.001；2 d时t=-10.378, P=0.01。P62蛋白与假手术组相比，1 d时t=6.43, P=0.002；2 d时t=5.781, P=0.004。

HE和PAS染色显示CLP术后1 d的小鼠肾脏肾小管刷状缘上皮细胞脱落，基底膜暴露，间质炎症细胞浸润，而假手术组改变不明显 (图 3箭头所示)。

图 3 CLP组和假手术组术后1 d小鼠肾脏的HE和PAS染色的病理学改变 Figure 3 The pathological alteration of mice kidney tissue on 1 d after CLP between CLP and Sham group by HE and PAS staining

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电镜显示CLP术后1 d的小鼠肾脏可发现自噬小体和吞噬泡现象，而假手术组改变不明显 (图 4箭头所示)。

图 4 CLP组和假手术组术后1 d小鼠肾脏的电镜超微结构改变 Figure 4 The ultrastructural chang of mice kidney tissue on 1 d after CLP between CLP and假手术group by electron microscope

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免疫组化显示Klotho蛋白和LC3-Ⅱ蛋白主要分布于小鼠肾小管胞浆内。CLP术后1 d，Klohto蛋白明显减弱，LC3-Ⅱ蛋白明显增浓，与假手术组相比差异具有统计学意义 (P < 0.01)(见图 5)。(Klotho蛋白表达：与假手术组相比，t=-8.371, P < 0.01；LC3-Ⅱ蛋白表达：与假手术组相比，t=4.995, P=0.001)。

Klotho蛋白表达与假手术组相比较，aP < 0.01；LC3-Ⅱ蛋白表达与假手术组相比，bP < 0.01 图 5 免疫组化检测CLP组和假手术组术后1 d小鼠肾脏组织的Klotho蛋白和LC3-Ⅱ蛋白的表达和分布 Figure 5 The expression and distribution of Klotho and LC3-Ⅱin mice kidney tissue on 1 d after CLP between CLP and Sham group by immunohistochemistry

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脓毒症是由感染、创伤等因素引起的全身炎症反应综合征，是临床常见的急危重症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征，具有来势凶猛、进展迅速、预后差的特点。目前脓毒症的研究虽然已取得很大进展，但脓毒症引起MODS的病理生理机制并不十分明确^[5]。脓毒症所致器官损伤主要表现为出现时间早、受累脏器多、干预措施少等特点，其难治性及高病死率一直是急危重症学科的重点和难点。每年约有3 100万脓毒症和2 400万严重脓毒症患者，其中约600万死亡^[19]。肾脏是脓毒症发生发展过程中极易受损害的脏器之一。因此，早期监测评估脓毒症患者的病情，及时采取积极有效的干预具有重大意义。本实验采用经典的CLP术来制备脓毒症小鼠模型，这是目前公认的与临床相关性较强的脓毒症模型^[20]，本研究发现肾功能血肌酐、尿素氮在造模后明显升高，病理光镜HE和PAS染色发现小鼠肾脏肾小管刷状缘上皮细胞脱落，基底膜暴露，间质炎症细胞浸润，这些均提示脓毒症急性肾损伤造模成功，为后续的进一步研究提供了基础。

体内Klotho蛋白有膜型和分泌型两种形式，分别发挥不同的作用。研究发现膜型Klotho具有调节钙磷代谢，抗凋亡等作用，它是骨源性激素成纤维生长因子23(fibroblast growth factor 23，FGF23) 的一个共同受体，主要在慢性肾脏病 (CKD) 方面发挥作用^[11]。而分泌型Klotho蛋白，在体内作为一种内分泌激素起作用，能够在血液，尿液和脑脊液中被检测到。在AKI中，主要是激素样的分泌型Klotho发挥作用。

研究发现，在AKI大鼠和小鼠中，随着肾功能损伤的进展，肾脏、血液和尿液中Klotho蛋白均显著减少，而当肾功能恢复后体液和组织中Klotho蛋白的水平又可以恢复到正常水平。同样在人体研究中也发现，与健康对照者相比，AKI患者的尿液中Klotho蛋白水平显著降低。这些均提示AKI是一种Klotho蛋白缺失的急性、暂时性的病理状态^[12]。研究发现在AKI时Klotho蛋白减少发生时间非常早，在肾脏损伤后3 h即可检出，其变化早于血清肌酐，甚至早于最近被公认为可能是肾损伤早期检测标志物的尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 (NGAL)^[21]。本研究发现，Klotho蛋白浓度从3 h开始逐渐变淡，至1 d时达最低值，2 d时有所恢复，然后逐渐转浓，变化趋势与文献[21]相符。Klotho对缺血和中毒引起的AKI均有不同程度的保护作用。研究发现Klotho蛋白缺陷可以加重肾缺血-再灌注导致的组织损伤，用腺病毒将Klotho基因转入致过表达可以缓解损伤，进一步证明了Klotho蛋白表达的变化在肾缺血-再灌注损伤的病理生理过程中起着重要作用^[22]。同样在顺铂诱导的AKI模型中也发现，Klotho基因缺失的小鼠AKI的程度较重，而在Klotho基因过表达的小鼠中AKI可以被缓解^[23]，证明Klotho对顺铂诱导的AKI有一定的保护作用。

大量证据表明自噬参与各种细胞生理及病理过程。大多数细胞存在基础水平的自噬，这对于组织细胞的发育，细胞本身的代谢需求及某些细胞器的更新有着重要的意义。但是，过多或过少的自噬却危害细胞。自噬也参与了多种疾病的发生，如心脏疾病、神经退行性疾病、感染、癌症、血液病、肿瘤等。近年来，在AKI中，越来越多的证据表明肾缺血-再灌注诱导期和顺铂、环孢素和环境毒素等肾毒性药物在近端肾小管细胞都可诱导自噬的发生^[14-18]。而在脓毒症急性肾损伤中，自噬的改变尚未被研究。本实验中电镜显示CLP术后1 d的小鼠肾脏出现自噬小体和吞噬泡现象，提示脓毒症急性肾损伤小鼠存在自噬激活的现象。

自噬相关蛋白包括LC3和P62，自噬是表现为LC3-Ⅰ转变为LC3-Ⅱ的过程，以及P62的降解过程，所以自噬增强表现为LC3-Ⅱ变浓以及P62同步地变淡，其变化趋势有时间依赖性。本实验发现，LC3-Ⅱ从3 h开始逐渐增浓，至1 d时达峰值，2 d时有所下降，然后逐渐变淡，而P62与LC3-Ⅱ反应相反，更进一步支持自噬的激活作用，在1 d这个时间点最显著。而自噬的激活过程与Klotho正好相反。免疫组化显示Klotho蛋白和LC3-Ⅱ蛋白主要分布于小鼠肾小管胞浆内。CLP术后1 d，Klohto蛋白明显减弱，LC3-Ⅱ蛋白明显增浓。因此笔者认为脓毒症急性肾损伤是表现为Klotho减少，自噬增强的一个过程。

综上所述，本实验用盲肠结扎穿刺术 (CLP) 成功复制了脓毒症急性肾损伤模型，发现脓毒症急性肾损伤是Klotho减少，自噬增强的一个过程，Klotho和自噬的表达具有一定的时间依赖性。具体相关机制还有待进一步的深入研究。