脓毒症是一种复杂的临床疾病，其主要特点是由感染引起的全身性炎症反应综合征 (systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，目前已经成为ICU患者的主要死亡原因。在过去的10年，尽管一直在研究可定义脓毒症阶段及严重程度和治疗的标志物，目前主要的标志物有CRP、PCT、IL-6和可溶性髓系细胞触发受体-1(sTREM-1) 等，但它们也出现在非感染炎症反应过程中^[1]。microRNAs (miRNAs) 是一种长度为19~25个核苷酸的非编码RNA^[2]，抑制基因表达通过mRNA的降解、翻译抑制或转录后抑制^[3]。循环miRNAs作为疾病的生物标志物被大量研究，如miR-223、146a、150已确定对脓毒症的诊断和预后有价值。近来，许多细胞内miRNAs亦被证实可调控TLR2/4-NF-κB信号通路。因此本文就循环miRNAs在脓毒症诊断和预后中价值，以及细胞内miRNAs调控炎症信号通路作一综述。

1 miRNAs的作用机制

miRNA首先在RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ, RNaseⅡ) 作用下被转录成长片段的初始miRNA，具有数百至上千碱基对序列的多茎环结构。然后在RNaseⅢ家族酶关键区域基因8(DiGeorge syndrome critical region 8，DGCR8) 复合体的作用下剪切成约60~70个核苷酸且具有单茎环结构的前体。前体在运输蛋白5的作用下从细胞核到达细胞质，在RNaseⅢ家族酶Dicer作用下剪切成约19~25个核苷酸长度的成熟miRNA。

miRNAs对靶基因主要发挥负调控作用，每个miRNA可以有多个靶基因，几个miRNAs也可调节同一靶基因。成熟miRNA的功能链与Argonaute (AGO) 蛋白结合形成RNA诱导沉默复合物 (RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC主要通过与靶mRNA的3‘非转录区 (3‘UTR) 识别，导致mRNA的降解或翻译抑制。miRNAs在进化上高度保守，在血浆或血清中非常稳定，可抵抗内源性和外源性RNases的活动，例如在极端pH、沸水、反复冻融8次等情况下仍高度稳定，可能与循环miRNAs包含在微泡、蛋白复合物以及脂蛋白复合物中有关^[4]。

2 循环miRNA表达量变化与脓毒症诊断及预后的关系

循环miRNAs存在于血液、汗液、尿液和乳汁中，便于检测和临床应用。近年来，许多研究已经谱出脓毒症患者血浆中miRNAs，其中一些被已被阐明作为脓毒症诊断和预后的标志物。大量研究表明miRNAs在疾病期间及其疾病的不同阶段会出现表达量的变化，并且具有器官组织的表达特异性^[5]，因此miRNAs表达量变化可望用于脓毒症的早期诊断及判断预后。

2.1 循环miRNA表达量变化与脓毒症诊断

Sun等^[6]比较ICU脓毒症和非脓毒症患者血清miR-181表达水平，发现脓毒症组血清miR-181表达量比对照组减少40%。使用定量PCR检测与炎症和感染有关的7个miRNAs (miR-132、146a、155、223、15b、126和let-7i)，相对于对照组，脓毒症组血清中miR-146a和miR-223表达量显著降低^[7]，SIRS组miR-146a表达量升高^[8]。这些研究表明miR-223和miR-146a可能是诊断脓毒症的最佳工具。已有研究筛选出214个脓毒症患者血清差异表达miRNAs^[8]，发现死亡组miR-223表达量显著降低^[9]。使用基因敲除小鼠模型，观测到敲除pre-miR-223会加重脓毒症诱导的心肌功能障碍，增加炎症反应和病死率。因此miR-223有用于诊断和靶向治疗的潜力。

研究报道miR-133a表达量上调与脓毒症的严重程度有关，在盲肠结扎穿孔术 (CLP) 诱导的脓毒症小鼠血清中，与miR-150、155、125b比较，miR-133a表达量升高了16倍^[10]。Wu等^[11]使用微阵列分析CLP诱导的C57BL/6小鼠脓毒症模型发现，CLP组miR-16、17、20a、20b、26a、26b、106a、106b、195、451表达量升高。进一步在CLP诱导的TLR2-/-，TLR4-/-和NF-κB-/-小鼠模型上分析，相对于TLR2 +/+，TLR4 +/+和NF-κB +/+小鼠，这些miRNAs没有显著差异表达。这些结果表明循环血中10种miRNAs的表达不依赖TLR2 /TLR4或NF-κB依赖的信号途径。Huang等^[12]使用微阵列表达谱和miRNA调控网络分析探讨了miRNAs作为脓毒症生物标志物的有效性，发现miR-15a、16、122、146a、223、499-5p、150对脓毒症有诊断价值。

2.2 循环miRNA表达量变化与脓毒症预后

miR-150表达量下调与炎症和细菌感染有关。miR表达谱分析发现脓毒症患者外周血miRNAs表达量下调，脓毒症组miR-150表达量降低与疾病的严重程度有关^[13]，低表达量会增加器官功能紊乱和病死率^[14]。由此推测miR-150在脓毒症预后起重要作用。

Wang等^[15]发现差异表达的miRNAs中，只有miR-297和miR-574-5p表达量在存活组和死亡组之间显著不同，存活组中miR-297表达量下调而miR-574-5p表达量上调，进一步验证发现miR-574-5p在预测脓毒症预后时有更高的价值，此外miR-483-5p、574-5p、193b也可能对脓毒症有助于预后判断^[12]。Li等^[16]发现相对于脓毒症存活组，死亡组白细胞中miR-466I表达量高，但两组的血清中miR-466I表达量无差异。

以上研究表明，许多循环miRNAs随脓毒症的病程进展出现表达量变化，提示miRNAs用于脓毒症诊断和预后的价值，如miR-223、146a、150。

3 脓毒症细胞内miRNAs作为炎症信号的调控者

一般脓毒症过程中的炎症反应由巨噬细胞和单核细胞TLRs的激活和下游NF-κB途径介导的^[17]。识别脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS) 后，TLR募集接头蛋白髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)，MyD88募集IL-1受体相关激酶 (IL-1 receptor-associated kinases，IRAK)。IRAK使肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-activated factor，TRAF6) 蛋白磷酸化，这种相互作用促使募集转化生长因子活化激酶1(transforming growth factor-activated kinase 1，TAK1)，TAK1使核因子κB抑制物激酶β(IKKβ) 磷酸化，同时激活IKK复合物^[18]。IKK使内源性抑制性蛋白 (IκBa) 磷酸化来解除IκBa对NF-κB转录因子上的抑制效应。NF-κB才能进入细胞核中激活炎症基因的表达。最新的研究表明许多细胞内miRNAs在TLR信号和NF-κB介导的炎症反应起重要作用。

3.1 Let-7i负调控TLR4

Let-7i可靶向结合Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)，通过转录后抑制TLR4表达。隐孢子虫感染人类胆道上皮细胞后，导致初始和成熟Let-7i通过MyD88/NF-κB依赖的途径表达量降低。Let-7i表达量降低与TLR4上调有关，而且Let-7i过表达会引起TLR4蛋白量降低^[19]。这些结果表明胆道上皮细胞Let-7i调控TLR4的表达并抗微小隐孢子虫感染的免疫反应。这些研究提出了miRNAs介导的转录后抑制通路可能是宿主细胞抗细菌反应的关键通路。

3.2 miR-200b、200c、149、203负调控MyD88

Wendlandt等^[20]发现200b、200c可调控TLR4信号和NF-κB的激活。miR-200b和miR-200c转染含MyD88的3‘UTR荧光素酶报告基因，报告基因活性下降而miR-200b和miR-200c转染突变的MyD88的3‘UTR，它的活性基本没有变化，对TLR4、IRAK1和TRAF6的3‘UTR活性没有影响，表明MyD88是miR-200b和miR-200c作用靶点。Xu等^[21]的研究表明miR-149可负调控MyD88蛋白含量，抑制其翻译而不抑制其转录。同样Wei等^[22]表明miR-203在小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7细胞中过表达可显著减少MyD88蛋白含量而不是mRNA表达量。

3.3 miR-146家族负调控RAK1和TRAF6

miR-146家族 (miR-146a、146b) 负调控RAK1和TRAF6的翻译。Tagonov等^[23]研究miR-146家族在NF-κB依赖的免疫反应的作用。构建含RAK1和TRAF6的3‘UTR荧光素酶报告基因检测，当miR-146a、146b转染HEK293，发现荧光素酶活性显著降低。Curtale等^[24]研究表明miR-146b通过作用于TLR4受体、MyD88、RAK1和TRAF6来影响TLR4信号通路，miR-146b转染荧光素酶标记的HEK293，发现含TLR4、MyD88、RAK1和TRAF6的3‘UTR的报告基因活性降低。进一步验证观察到，将miR-146b转染含TLR4、MyD88、RAK1和TRAF6的3‘UTR突变区的报告基因中，报告基因的活性没有变化。

3.4 miR-15、16、223、199a负调控IKK，miR-126负调控IκBa

IKK (IKK-α、IKK-β和IKK-γ) 是NF-κB激活所必需的，Li等^[25]发现miR-15a、16、223与IKK-α基因的3‘UTR互补，当GM-CSF刺激分化的人类单核细胞时，miR-15a、16、223表达量降低而IKK-α水平升高。miR-15a、16、223 mimics转染人类单核细胞会导致IKK-α蛋白含量的降低，Chen等^[26]使用PicTar算法，发现IKK-β mRNA的3‘UTR与miR-199a有三个互补序列。miR-199a和构建含IKK-β的3‘UTR荧光素酶联合转染卵巢癌细胞导致荧光素酶活性下降。IκBa的3‘UTR和miR-126序列互补，当miR-126 mimic转染肠癌细胞HT29会导致IκBa蛋白含量降低了57%^[27]。

3.5 miR-221、579、125b负调控促炎因子TNF-α

miRNAs可以直接作用于炎症过程中产生的促炎因子，El Gazzar和McCall^[28]利用计算目标预测算法来识别miR-221、579、125b，作为与TNF-α的3‘UTR互补的可能的候选miRNAs，它们在LPS耐受的THP-1细胞中证实了miR-221、579、125b作用于TNF-α上的抑制效应，miR-221转染THP-1细胞促使TNF-α的mRNA的降解而miR-579和miR-125b的转染则会导致TNF-α的蛋白含量显著减少。Tili等^[29]报道了miR-125b作用于TNF-α蛋白表达上的抑制效应，miR-125b和构建含TNF-α的3‘UTR荧光素酶联合转染HEK-293，观测到荧光素酶活性降低。

3.6 其他影响炎症信号的miRNAs

PDCD4是协助NF-κB激活的促炎蛋白，Sheedy等^[30]的研究表明miR-21调控PDCD4的表达，miR-21的反义寡核苷酸转染LPS处理的RAW264.7细胞导致PDCD4表达量升高，而转染miR-21的前体会导致PDCD4的低表达和IL-10的高表达。因此miR-21可能抑制PDCD4作用于NF-κB活性上的效应并促使抗炎因子生成。受体相互作用蛋白激酶140(receptor interacting protein 140，RIP140) 是与NF-κB有关的协助促炎因子转录的核蛋白，miR-33作用于RIP140 mRNA的3‘UTR。miR-33转染RAW264.7巨噬细胞后，RIP140、TNF-α和IL-1β mRNA表达量降低^[31]。Sweeny等^[32]报道金黄色葡萄球菌感染的TLR2-/-和TLR4-/-小鼠，氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PPARGC1A) 基因线粒体表达量失调，PPARGC1A是转录协调因子PGC家族的一员，参与线粒体的生物形成，当受到损害时激活^[33]。当miR-202-3p mimic转染小鼠肝细胞系 (AML12) 后，PPARGC1A基因mRNA表达量降低。使用silico分析PPARGC1A基因mRNA的3‘UTR揭示了miR-202-3p的结合位点，确认miR-202-3p的活性与PPARGC1A呈负相关^[30]。

4 结语

脓毒症的病理生理和临床表现是复杂的，miRNAs作为新兴的生物标志物在未来的疾病诊断和治疗中会有很好的应用前景。尽管上述大量的miRNAs已被证实调节炎症反应，然而治疗脓毒症有效的细胞内miRNAs仍无人涉足。此外，尽管miRNAs被认为是TLR-NF-κB通路的关键调控因素，但在脓毒症领域还没得到广泛而深入的研究。所以用于针对特定介质或通路的抑制炎症反应的治疗性干预措施并未改善预后。因此，继续研究循环和细胞内miRNAs在脓毒症中的作用，不仅可以帮助我们理解脓毒症复杂的性质，也为有效的治疗提供新的见解，有望使其从实验走向临床。