2017, Vol. 26
百草枯 (paraquat，PQ) 是有机杂环类除草剂，被广泛应用于农业生产，它对人和动物均有毒性[1]。PQ可以通过皮肤、呼吸道、消化道吸收进入体内，消化道是主要的中毒途径。PQ中毒后，可引起肾脏、肺脏、心脏等多器官损伤[2-4]，肺是主要的靶器官，早期以肺充血、水肿、炎性细胞浸润为主要特征[5]，但其机制尚未完全阐明。白细胞介素-17A (interleukin-17A, IL-17A) 是新近发现的Th17型T辅助细胞的主要效应因子，作为促炎因子，IL-17A参与脓毒症和博来霉素导致的肺组织损伤[6-7]。近年研究表明，阻断IL-17A能够限制急性肺损伤 (ALI) 的发展[6, 8]。然而，IL-17A在PQ中毒致ALI中的作用如何，国内外鲜有这方面的报道。本实验采用5 mg/mL的PQ溶液一次性经口灌胃25 mg/kg建立急性PQ中毒动物模型，用IL-17A抗体干预，观察Th17细胞相关细胞因子IL-17A、IL-22、IL-6、转化生长因子-β(TGF-β) 等的变化与急性肺损伤的关系，探讨IL-17A与PQ所致ALI的关系，进一步研究急性PQ中毒肺损伤的可能机制，并为临床治疗提供新的靶点。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器PQ溶液 (浓度为25%，陕西加伦多有限公司)，IL-17A、IL-22、IL-6、TGF-β ELISA试剂盒购于北京博奥拓达科技有限公司，小鼠IL-17A中和性抗体 (美国eBiosicence公司)，IL-23R免疫组化试剂盒 (英国abcam公司)，mRNA引物 (上海生工生物工程股份有限公司)。
实时荧光定量PCR仪带HRM Roche lightcycle48Ⅱ(德国/瑞士Roche公司)，紫外可见光分光光度计 (微量) NanoPhotometer (德国IMPLEM公司)，DNA扩增仪9700(美国ABI公司)，微板阅读仪SUNRISE RC (瑞士TECAN公司)，实验室冷冻离心机UNIVERSAL 32R (德国HETTICH公司)，显微镜集成显像照相系统AX70+U-PHOTO (日本OLYMPUS公司)，自动石蜡切片机RM2155(德国LEICA公司)。
1.2 动物分组与处理SPF级健康ICR雄性小鼠120只，体质量22~26 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供。随机 (随机数字表法) 将小鼠分为3组：生理盐水对照组 (NS)、PQ中毒组 (PQ) 和抗体中和组 (PQ+Ab)，每组40只。PQ组和PQ+Ab组小鼠以25 mg/kg的剂量一次性经口灌胃建立中毒模型，PQ+Ab组每只小鼠于染毒后立即经腹腔注射5 μg IL-17A中和性抗体，NS组小鼠给予相应量的生理盐水。
1.3 标本采集染毒后按8 h、1 d、3 d、5 d、7 d时每组各取6只存活小鼠进行实验，用10%的水合氯醛按0.3 mL/100 g的剂量腹腔注射麻醉，处死小鼠后，留取以下样本：①取小鼠全血，离心后取上层血清置于-20 ℃冰箱保存、备用，待做细胞因子检测; ②分离出左肺组织，用干纱布拭干表面后立即称质量，记为肺湿质量 (W)；③分离出右肺组织，取右上肺经10%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，用于HE染色病理观察和免疫组化检测；④取右下肺用液氮速冻置于-80 ℃冰箱保存、备用，待做PCR。
1.4 检测指标及方法 1.4.1 肺湿干比 (W/D)将称质量后的左肺组织放于80 ℃烤箱中，48 h后取出称质量，记为肺干质量 (D)，两者的比值记为肺W/D。
1.4.2 肺组织病理石蜡包埋的肺组织做5 μm切片，进行HE染色，光镜下观察肺组织的病理变化。
1.4.3 肺组织IL-23R表达水平采用免疫组织化学法评估，依次通过切片、脱蜡、水化、抗原修复后，加血清封闭液孵育，滴加一抗过夜，PBS冲洗，加入二抗孵育，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染, 阴性对照用PBS代替一抗。
1.4.4 细胞因子测定采用ELISA法检测血清中IL-17A、IL-22、IL-6、TGF-β水平，操作遵照试剂盒说明书进行。
1.4.5 qRT-PCR法检测肺组织RORγtmRNA的表达 (1) RNA提取。取右下肺组织50 mg，采用Trizol试剂提取肺组织总RNA。(2) 检测。RNA样本浓度和纯度检测后，按照试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA，然后进行RORγt及内参GAPDH基因扩增。mRNA引物由上海生工公司合成，引物序列：RORγt上游5’ACCCAGCCTTTCCCCTT TCT3’，下游5’GCCTTTTCTCCATCACTTGC3’，扩增长度126 bp；GAPDH上游5’GGTTGT CTCCTGCGACTTCA3’，下游引物5’TGGTCCA GGGTTT CTTACTC3’，扩增长度127 bp。
反应条件：37 ℃逆转录15 min，95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，40 ℃退火延伸30 s，共40个循环。将反应体系加入到Roche 96孔荧光定量PCR板中，在Roche lightcycle48 Ⅱ定量PCR仪上进行反应；同时绘制溶解曲线，以保证荧光定量PCR的特异性。通过比较目的基因RORγt与内参基因GAPDH的比值，分析目的基因mRNA表达量。
1.5 统计学方法应用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差 (x±s) 表示，多组均数间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析 (ANOVA)，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Games-Howell检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 小鼠肺湿干比 (W/D) 变化与NS组比较，PQ组与PQ+Ab组肺W/D先升高后降低，在72 h时达到高峰，且在各时间点均高于NS组 (P＜0.01)；与PQ组比较，PQ+Ab组肺W/D在各时间点均低于PQ组 (P＜0.05)，见图 1。
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| 与NS组比较，aP＜0.01；与PQ组比较，bP＜0.05;8 h~7 d：三组间比较，均P＜0.01 图 1 各组小鼠肺W/D变化 Figure 1 Changes of lung W/D in mice of each group |
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NS组小鼠肺泡结构完整清晰，间隔无增厚。PQ组与PQ+Ab组可见大量炎症病灶形成，肺泡腔扩张融合，肺泡间隔明显增宽，肺泡内可见大量炎性细胞和红细胞，随染毒时间的增加，肺泡结构破坏加重，肺泡间隔进一步增厚，第5天时肺实质炎症开始有所吸收；同一时间肺泡间隔充血、水肿、炎性细胞浸润、肺泡结构破坏等表现PQ+Ab组较PQ组减轻。每张切片随机选取5个明视野从以下几方面进行病理损伤程度的评定[9]：肺泡内水肿，出血，炎细胞浸润，肺不张，透明膜形成。评分标准：无损伤，0分；损伤＜25%, 1分；25%＜损伤＜50%，2分；50%＜损伤＜75%，3分；损伤＞75%，4分。肺病理损伤评分见图 2，HE染色见图 3。
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| 与NS组比较，aP＜0.01；与PQ组比较，bP＜0.05;8 h~7 d：三组间比较，均P＜0.01 图 2 各组小鼠肺损伤评分 Figure 2 Mice lung injury scores of each group |
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| A:NS组；B:PQ组1 d；C:PQ+Ab组1 d 图 3 HE染色光镜下肺组织表现 (×400) Figure 3 Lung tissue stained with HE under light microscope (×400) |
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随着血清中IL-17A浓度的升高，肺组织病理损伤加重，呈正相关。
2.4 血清炎性因子水平变化PQ组与PQ+Ab组血清中IL-17A、IL-22、IL-6、TGF-β明显高于NS组 (P＜0.01或P＜0.05)；IL-17A、IL-22、TGF-β在8 h~7 d内水平持续增高，8 h~3 d内迅速增高；IL-6先增高后降低，3 d时达到高峰，随后开始下降，与PQ组比较，PQ+Ab组各时间点IL-17A、IL-22、IL-6、TGF-β水平均低于PQ组，(P＜0.01或P＜0.05)，见图 4~5。
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| 与NS组比较，aP＜0.05；与PQ组比较，bP＜0.05;8 h~7 d，三组间比较，均P＜0.01 图 4 各组小鼠血清中IL-17A变化 Figure 4 Changes of IL-17A in serum of each group |
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| 与NS组比较，aP＜0.01；与PQ组比较，bP＜0.01;8 h~7 d，三组间比较，均P＜0.01 图 5 各组小鼠血清中IL-22变化 Figure 5 Changes of IL-22 in serum of each group |
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| 与NS组比较，aP＜0.01；与PQ组比较，bP＜0.05;8 h~7 d，三组间比较，均P＜0.01 图 6 各组小鼠血清中IL-6变化 Figure 6 Changes of IL-6 in serum of each group |
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| 与NS组比较，aP＜0.01；与PQ组比较，bP＜0.01;8 h~7 d，三组间比较，均P＜0.01 图 7 各组小鼠血清中TGF-β变化 Figure 7 Changes of TGF-βin serum of each group |
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细胞质与细胞膜出现棕黄色颗粒则为IL-23R的阳性表达。400倍显微镜下随机选取肺组织切片染色区域5个高倍视野，使用Image proplus 6.0软件分析，以其平均吸光度值 (IOD SUM/AREA SUM) 表示IL-23R在肺组织中的表达强度。与NS组比较，PQ组和PQ+Ab组各时间点IL-23R表达水平均明显高于NS组 (P＜0.01)，呈先升高后降低的趋势，数值以第3天时最高；与PQ组比较，PQ+Ab组各时间点IL-23R表达水平均低于PQ组 (P＜0.01)；见图 8~9。
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| 与NS组比较，aP＜0.01；与PQ组比较，bP＜0.01;8 h~7 d，三组间比较，均P＜0.01 图 8 肺组织IL-23R免疫组化平均吸光度值 Figure 8 Mean optical density of IL-23R IHC in lung tissue |
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| A:阴性对照；B：NS组；C：PQ组8 h；D：PQ+Ab组8 h 图 9 免疫组化光镜下观察各组肺组织切片 (DAB×400) Figure 9 IHC in lung tissue under light microscope (DAB×400) |
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与NS组比较，PQ组与PQ+Ab组各时间点肺组织RORγt mRNA表达水平均升高 (P＜0.01)，在8 h~7 d内，RORγt mRNA表达水平先升高后降低，3 d时达高峰；与PQ组比较，PQ+Ab组RORγt mRNA表达水平均降低 (P＜0.05)，见图 10。
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| 与NS组比较，aP＜0.01；与PQ组比较，bP＜0.01;8 h~7 d，三组间比较，均P＜0.01 图 10 肺组织RORγt mRNA表达变化 Figure 10 Changes of lung tissue RORγt mRNA expression |
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急性PQ中毒往往导致多个器官功能损伤，其中肺损伤是PQ中毒病死率居高不下的主要原因。PQ导致的肺损伤包括早期急性肺充血、水肿等，进而发展为急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)，以及晚期进行性肺纤维化[10]。早期ARDS与晚期肺纤维化是PQ中毒致呼吸衰竭乃至死亡的主要原因。然而，PQ肺损伤的具体机制尚未完全阐明，目前，大多数学者认为脂质过氧化反应、肺泡损伤、细胞因子释放可能在PQ致ALI过程中起较为关键的作用。研究证实，PQ中毒后，肺泡单核巨噬细胞、Ⅱ型上皮细胞及中性粒细胞在毒性代谢产物和酶的作用下释放大量细胞因子参与肺组织损伤[11]。IL-17A是由辅助性Th17细胞特异性分泌的具有促炎作用的细胞因子，参与多种包括获得性和自身免疫性在内的多个器官损伤[12-13]。目前有关IL-17A在PQ中毒致ALI中的作用国内外鲜有报道。
本实验采用5 mg/mL的PQ溶液以25 mg/kg的剂量一次性经口灌胃建立急性PQ中毒动物模型。PQ染毒后，小鼠血清中IL-17A浓度迅速显著升高，第3天时达到峰值，并且伴随着IL-17A的升高，肺组织病理损伤加重；用IL-17A抗体干预后，血清中IL-17A浓度下降，小鼠肺组织病理损伤较未干预组明显减轻。本研究发现，PQ中毒后，小鼠肺病理损伤程度与血清中IL-17A浓度呈正相关，尤其是在中毒72 h内，血清中IL-17A浓度越高，肺病理损伤越严重；但在中毒72 h后，随着肺泡炎症的吸收，肺病理损伤有所减轻，肺组织湿干比 (W/D) 下降，血清IL-17A水平仍居高不下，这可能与IL-17A介导肺损伤晚期纤维化的发生发展有关。既往有研究表明，间质性肺纤维化的患者中，IL-17A的表达明显升高[14]，在博来霉素诱导的肺损伤和肺纤维化过程中，IL-17A起关键的作用，通过阻断IL-17A能够显著减轻肺损伤和肺胶原纤维的形成与沉积，从而减轻肺纤维化[7, 15-16]。已有研究表明，在PQ中毒所致肺组织损伤中，IL-17A不仅参与肺纤维化的形成期[17-18]，同样在肺组织损伤急性期起重要作用，这可能与IL-17A的募集作用有关。有文献报道称，IL-17A促使呼吸道上皮细胞分泌趋化因子 (CXCL)、IL-6、粒细胞集落刺激因子 (G-CSF) 和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)，进而招募中性粒细胞聚集于气道，加重炎症损伤[13]。本研究显示，PQ中毒后中和IL-17A，小鼠血清中IL-6水平降低，这表明在PQ中毒后，IL-17A同样促进IL-6的分泌，进而加重肺组织损伤。
既往研究证明，Th17细胞由T细胞分化而来，可分泌IL-17A、IL-22等细胞因子。原始T细胞在TGF-β和IL-6作用下由特异性转录因子维甲酸孤核受体 (RORγt) 介导向Th17细胞分化, 分化成熟的Th17细胞特异性地表达IL-23受体 (IL-23R)，并分泌IL-17A[12, 14-15, 19]，RORγt DNA失去结合活性后会抑制IL-17A的表达[20]。本实验研究显示，小鼠PQ中毒后，血清中Th17细胞相关的细胞因子IL-6、TGF-β、IL-22含量增加，RORγt mRNA的转录水平升高，肺组织中IL-23R表达增多。IL-17A抗体拮抗IL-17A后，血清中IL-22、IL-6、TGF-β水平明显下降，肺组织IL-23R的表达降低，RORγt mRNA转录水平下降。实验结果提示，PQ刺激后，在IL-6与TGF-β的共同作用下，RORγt mRNA转录活性增加，表达IL-23R的Th17细胞大量分泌IL-17A，IL-17A募集中性粒细胞损伤肺组织。同时，增多的IL-17A又刺激上皮细胞、内皮细胞等分泌IL-6、TGF-β，放大炎症级联反应；IL-17A抗体干预后，IL-6、TGF-β的分泌减少，级联效应减轻，肺炎症损伤减轻。此外，阻断IL-17A对Th17细胞的反馈效应，减少了IL-22的分泌。既往在脂多糖致小鼠肺损伤的研究中发现，Th17细胞分泌IL-22，激活P38MARK通路，进一步放大炎症反应[21-22]。实验结果表明，作为介导炎症反应的重要效应细胞，Th17细胞及其相关细胞因子同样参与PQ致小鼠急性肺组织损伤。
综上所述，IL-17A参与PQ引起的急性肺病理损伤过程，并在其中起重要作用；用IL-17A抗体中和IL-17A能够减轻PQ中毒肺组织损伤急性期的炎症程度；同时，Th17细胞及其相关的细胞因子也参与PQ中毒引起的ALI过程，阻断其相关通路，可能减轻肺组织的炎症损伤。本研究同时还表明，PQ中毒致ALI过程不仅仅由肺泡单核巨噬细胞其分泌的炎性因子等[11-12]固有免疫系统的参与，特异性免疫Th17细胞及其分泌的IL-17A在PQ中毒引起的ALI中同样起重要的作用，这为急性PQ中毒的进一步研究提供了实验和理论依据。
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