脂多糖(LPS)是引起炎症反应和休克的关键介质之一，常引起全身炎症反应并可导致多器官功能衰竭^[1]。LPS能够诱导心肌细胞炎症因子的表达，并导致心肌细胞肥大、凋亡以及心肌细胞的收缩功能减弱，最终导致充血性心脏衰竭^{[2, 3]}。心肌损伤是造成难治性低血压和脓毒症死亡的重要因素^{[4, 5]}，而急性心肌缺血造成的心肌损伤在研究中也越来越受到重视。缺氧处理很好的模拟了体内心肌缺血的模型，有利于进一步研究心肌损伤中炎症反应的作用机制。

Sirtuin1 (Sirt1) 作为一重要的去乙酰化酶具有重要的病理生理作用。癌症细胞中Sirt1表达下调可抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡^[6]；在乳腺癌细胞MCF-7细胞中，Sirt1活性的下降能显著诱导凋亡细胞的增加^[7]；在正常小鼠心脏中，Sirt1表达的增加能减少心肌细胞因缺血再灌注所引起的凋亡与梗死面积从而保护心脏^[8]。Sirt1蛋白在细胞的增殖与凋亡中起着非常重要的作用。尽管Sirt1也参与调控LPS的病理生理过程^[9]，然而其具体的调节机制仍不十分明了。但LPS对心肌细胞中微小RNA及Sirt1的影响机制还不是特别清楚。

微小RNA在细胞的各种新陈代谢中起着重要的调控作用^[10]。微小RNA密切参与了LPS的病理生理过程。LPS诱导A549细胞凋亡过程中，miR-15a、miR-15b、miR-203和miR-135a表达显著上调；而miR-23a、miR-205、miR-199和miR-497等表达显著下调。miR-135a表达的下调能解除其对靶蛋白Bcl-2的抑制从而使凋亡减少^[11]。在巨噬细胞RAW 264.7中，LPS作用上调了TLR4与MyD88的表达，同时下调miR-93的表达，进而使其靶蛋白IRAK4的表达上调从而促进炎症的发生发展^[12]。LPS能通过影响微小RNA的表达从而对细胞凋亡与炎症的发生发展进行调节。

Sirt1可能是microRNA-211(miR-211)潜在的靶点：miR-211可通过调控Sirt1表达水平而参与细胞的病理生理过程。miR-211在很多肿瘤细胞中是异常表达的，且与细胞的增殖与凋亡密切相关。miR-211在卵巢上皮癌细胞中是低表达的，而过表达miR-211能抑制卵巢上皮癌细胞的增殖与诱导细胞凋亡^[13]。为此，本文初步探讨了LPS是否可以通过上调miR-211，并进而下调Sirt1蛋白水平。这条信号通路可以参与LPS对心肌细胞的损伤作用。

新生SD大鼠(1~2 d年龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司)以分离乳鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes，NRC)。H9c2购自中国科学院上海生命研究科学院细胞资源中心。

脂多糖购自Sigma公司，CCK-8试剂盒、蛋白裂解液和BCA试剂盒等购自碧云天生物技术研究所； RNAiso plus、RT-PCR逆转录试剂盒、实时定量PCR酶及SYBR GREEN Ⅱ等购自TaKaRa公司； Sirt1抗体购自abcam公司；CO₂细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司； 荧光定量PCR仪7500 Fast real time system购自美国Applied Biosystems公司。

大鼠心肌细胞H9c2培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养。乳鼠心肌细胞由乳鼠心脏上分离：首先将心脏由乳大鼠上剥落下来剪成小碎块，然后置于0.1%胰酶与0.1%胶原酶混合液中消化，待全部消化后离心收集细胞接种到培养皿中培养90 min后吸取上清培养于20%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，这样得到的就是乳鼠心肌细胞；培养过夜待乳鼠心肌细胞贴壁后既可加入不同浓度的脂多糖进行处理。

取对数生长期的H9c2细胞，经胰酶消化后制成细胞悬液以合适浓度接种于96孔板中(1×10⁴ 细胞/孔)，培养过夜待细胞全部贴壁后分别加入不同浓度的脂多糖进行处理，4 h后全部换成新鲜的完全培养基继续培养0 h、24 h、48 h、72 h，然后按CCK-8操作说明书操作并测定吸光度值 (D450)。根据各孔吸光度绘制细胞生长曲线。

取对数生长期的H9c2细胞，经胰酶消化后制成细胞悬液以合适浓度接种于6孔板中(1×10⁵ 细胞/孔)，培养过夜待细胞全部贴壁后分别加入不同浓度的脂多糖进行处理；乳鼠心肌细胞分离出来培养过夜待细胞完全贴壁后同样加入不同浓度的脂多糖进行处理。然后采用RNAiso 试剂提取总RNA，根据Hairpin-it^TM miRNAs qPCR quantitation kit(上海吉玛)说明书进行操作检测miR-211的表达水平，U6作为内参对照。PCR引物序列如下：U6正向序列为5‘-CTCGGTTCGGCAGCACA-3’，反向序列为5‘-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’； miR-211正向序列为5‘-CGCTTCCCTTTGTCATCCT- 3’，反向序列为5‘-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3’。反应条件参照笔者以前的操作进行^[14] 。

H9c2细胞与乳鼠心肌细胞脂多糖处理4 h后收集细胞的总蛋白。对总蛋白定量、电泳、转膜及曝光分析按照笔者之前的操作进行^[15]。β-actin蛋白抗体按1 3 000进行稀释孵育，Sirt1蛋白抗体按1: 1 000进行稀释孵育。

使用荧光检测试剂盒(罗氏，美国)标记凋亡细胞并用荧光显微镜定量分析凋亡细胞。细胞经胰酶消化后制成细胞悬液以合适浓度分别接种于24孔板中(1×10⁵ 细胞/孔)，培养过夜后分别加入不同浓度的脂多糖进行处理4 h，然后换成无血清的培养基置于37 ℃、0.5% O₂ 的培养箱中进行诱导培养。在上述缺血清缺氧凋亡诱导条件下培养24 h后，拿出细胞，用10%的中性福尔马林固定10 min，然后PBS洗3次，每次3 min；接着用0.2%的tritonX-100通透10 min，PBS洗3次，每次3 min；然后按TUNEL操作说明书，分别将A、B液按照1: 9进行混合配成TUNEL反应混合液，均匀覆盖于细胞上，置于37 ℃孵育1 h，PBS洗净后用含有DAPI的Hochest封片在荧光显微镜下进行观察并分析。

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示。两组间比较用Student’ s t检验；多组间比较用One-Way ANOVA方差分析，以 P<0.05为差异具有统计学意义。

不同浓度脂多糖处理4 h后，心肌细胞H9c2在0~72 h期间细胞增殖能力的变化情况。心肌细胞H9c2在10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL不同浓度的脂多糖处理4 h后，细胞的增殖能力与未处理的细胞在24 h、48 h、72 h时相比差异无统计学意义。脂多糖在合适的浓度下短时间处理对心肌细胞H9c2的增殖没有显著影响。见图 1。

CCK8检测表明LPS处理对H9c2心肌细胞增殖无明显影响 图 1 LPS对心肌细胞H9c2增殖的影响 Fig 1 The effect on H9c2 cell proliferation after LPS treated

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用20 μg/mL、40 μg/mL两个浓度分别对乳鼠心肌细胞与H9c2处理4 h，然后进行缺氧缺血清凋亡诱导培养24 h。结果表明，与未处理的细胞相比，脂多糖处理过的心肌细胞凋亡率有显著的增多：乳鼠心肌细胞凋亡由未处理时的3.3%上升至7%与8%左右(图 2A与2C)，凋亡增加超过100%；H9c2细胞由未处理时的1.3%上升至2.8%与3.2%左右，凋亡增加同样超过100%(图 2B与2D)。

A、C： 4 h后心肌细胞缺氧诱导凋亡；B、D： 4 h后心肌细胞H9c2缺氧诱导凋亡的影响; 与LPS未处理组比较,aP<0.05，bP<0.01 图 2 LPS对心肌细胞凋亡的影响(TUNEL× 200) Fig 2 The effect on myocardial cells cell apoptosis after LPS treated(TUNEL × 200)

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LPS能诱导细胞凋亡可能与其诱导微小RNA的表达相关，此本研究中检测了LPS处理4 h后miR-211的表达变化。结果表明LPS处理4 h后，大鼠乳鼠心肌细胞与H9c2心肌细胞中miR-211的表达均显著上调。这些结果提示LPS有可能是通过上调miR-211的表达来诱导细胞凋亡的，见图 3。

A：心肌细胞4 h后miR-211表达水平的变化；B：H9c2心肌细胞4 h后miR-211表达水平的变化;与LPS未处理组比较，aP<0.05，bP<0.01 图 3 LPS对心肌细胞中miR-211表达的影响 Fig 3 The miR-211 expression after LPS treated on myocardial cells.

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Sirt1是miR-211的潜在靶蛋白，提示LPS有可能是通过上调miR-211表达，进而抑制其靶蛋白Sirt1的表达来调控缺氧诱导的心肌细胞凋亡的。因此检测了LPS处理4 h后Sirt1的表达水平在NRC与H9c2心肌细胞中的表达变化。结果表明，LPS处理4 h后，NRC心肌细胞中的Sirt1蛋白表达水平下降了40%左右；而H9c2心肌细胞中Sirt1蛋白表达水平下降达到了60%左右。LPS对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响有可能是通过上调miR-211的表达进而抑制其靶蛋白Sirt1的表达这条通路来起作用的。见图 4。

A：MiR-211在Sirt1 3’UTR的潜在结合位点；B：LPS分别对乳鼠心肌细胞与H9c2心肌细胞中Sirt1表达的影响 图 4 LPS对心肌细胞中Sirt1表达的影响 Fig 4 The Sirt1 expression after LPS treated on myocardial cells

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微小RNA是一类高度保守、具有调控功能的内源性非蛋白编码RNA，对维持细胞的生长有着重要作用^[16]。miRNAs在一些炎症反应及免疫系统中起着越来越重要的作用^{[17, 18]}。在上皮细胞中，LPS作用使miR-17表达下调从而上调促凋亡因子FoxA1的表达促进细胞凋亡，说明miRNAs在促凋亡中也起着重要作用^[19]。葛晨等^[20]发现在盲肠结扎穿孔术制备的小鼠脓毒症模型中，miR-214的表达是升高的，同时miR-214过表达能减少心肌细胞的凋亡从而对心肌损伤起到保护作用，说明miRNAs在保护心肌损伤中也起着重要作用。

miR-211在很多肿瘤细胞中均是异常表达，在癌细胞的增殖浸润与迁移中起着重要作用^{[21, 22]}。数据显示：联合miR-211的靶向治疗能显著诱导神经胶质瘤细胞的凋亡与DNA损伤^[23]。某些miRNAs也可以调控Sirt1的表达。在人结肠癌细胞中miR-34a通过作用其靶蛋白Sirt1来调节细胞凋亡^[24]；而Fe等^[25]在大鼠肝脏细胞中发现miR-34a调控Sirt1在脱氧胆酸诱导的细胞凋亡中起着重要作用。在心肌细胞，Zhu等^[26]应用培养的新生小鼠心肌细胞，显示miR-195通过调控Sirt1表达在棕榈酸酯诱导心肌细胞凋亡中起着重要的作用。这些研究均表明miRNAs可以通过Sirt1在细胞凋亡调节中起着重要作用。本研究发现LPS对心肌细胞的增殖并无明显作用，这可能是由于不同细胞之间的特异度造成的；但发现LPS确实能显著增加缺氧诱导的心肌细胞凋亡，这跟LPS促进其他细胞增殖的结果的是一致的，表明LPS在心肌细胞的凋亡中也起着非常重要的作用；进而笔者进一步研究发现LPS能显著上调心肌细胞中miR-211的表达并抑制其靶蛋白Sirt1的表达；这些研究均表明miR-211同样也可以通过调控Sirt1表达而参与LPS诱导NRC凋亡的过程。临床研究表明，慢性心力衰竭患者血清内LPS水平升高^[27]，提示脂多糖是心肌细胞在应激状态下分泌增多，是其炎症反应的一个重要表现。尽管LPS本身对心肌细胞损伤作用已被大量数据所证实，然而LPS通过上调miR-211表达并进而下调Sirt1蛋白水平将是另一崭新的分子机制。在本研究中没有进一步研究缺氧条件下miR-211与Sirt1表达的改变，存在一定的局限性。