缺血性脑卒中是临床上常见神经系统疾病，而恶性缺血性脑卒中患者神经功能恶化和病死率可高达40%～80%^[1]，脑缺血灶周围大量的炎症介质可加重脑组织损害^[2]。近年来研究发现Notch信号通路与缺血脑损伤时神经炎症介质的释放密切相关^[3]，而小胶质细胞是神经炎症介质的主要来源^{[4, 5, 6]}。研究表明高渗盐水可抑制脑缺血后小胶质细胞释放炎症介质IL-1β、TNF-α、MCP-1，但其具体分子机制尚不清楚^{[7, 8]}。而高渗盐水抑制小胶质细胞炎症介质释放是否与Notch信号通路相关，目前还没有相关研究报道。本研究通过线栓法制作大脑中动脉局灶脑缺血再灌注模型，探索高渗盐水对脑缺血后小胶质细胞Notch信号通路的影响,更为深入探讨高渗盐水降低脑梗死，减轻神经炎症的分子基础,为高渗盐水治疗脑梗死提供理论支持。

免疫荧光显微镜(Olympus DP73 Microscope，Olympus，日本)；蛋白成像仪(ImageQuant LAS 500，瑞典)；定量PCR仪(MJ option 2，美国)；逆转录试剂盒(TAKARA，大连，中国，货号：DRR036S)；PCR定量试剂盒 (TAKARA，中国，货号：DRR820A)；一抗：Notch1 (Cell Signaling Technology，美国，货号：4380)；NICD(Cell Signaling Technology，美国，货号：4147)；β-actin(Cell Signaling Technology，美国，货号：3700)；Lectin(Sigma，美国，货号：L0401)；二抗：羊抗兔-HRP(Cell Signaling Technology，美国，货号：7074)；羊抗小鼠- HRP(Cell Signaling Technology，美国，货号：7076)；羊抗兔荧光二抗(A-21428，Life Technologies，美国)。

72只220～250 g成年健康SD大鼠，随机(随机数字法)分为假手术组、脑缺血组、生理盐水组(简称NS组)、10%高渗盐水治疗组(简称10%HS组)。除假手术组大鼠外，其他各组大鼠采用线栓法复制右侧大脑中动脉局灶脑缺血模型，缺血2 h后实施再灌注，以再灌注的时间点作为治疗起点，NS组和10%HS组按0.3 mL/h分别经尾静脉匀速泵入NS和10%HS。治疗24 h后提取缺血侧脑组织，用Western Blot的方法检测缺血灶周围Notch1、NICD的蛋白表达(每组n=6)，用RT-PCR方法检测缺血灶周围Notch1 mRNA的表达(每组n=6)，用免疫双标法检测缺血灶周围Notch1、NICD与小胶质细胞(Lectin标记)的共定位表达(每组n=6)。

所有大鼠随机分组，术前12 h禁食但不禁水。脑缺血模型根据文献^[9]再加以改进，大鼠经10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后，颈部正中切口，分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉；在颈总动脉近心端结扎血管，在颈动脉分叉处结扎颈外动脉，夹闭颈内动脉；在颈总动脉远心端作一小切口，随后将线栓沿该切口顺颈内动脉方向插入，当线栓顶端距颈动脉分叉处约18～20 mm并有中度阻力感时停止插入，此时代表线栓已阻断大脑中动脉的血液供应。2 h后，再将线栓拔出约1 cm以进行再灌注，同时以Longa五分法进行神经行为学评分，1～3分作为有效模型。假手术组只分离颈部血管，不做结扎，也不插入线栓。

治疗24 h后，迅速取大鼠缺血灶周围脑组织，用Trizol提取总RNA并按照逆转录试剂盒说明书将提取的RNA逆转录成cDNA；按照10 μL Real Time PCR反应体系进行扩增，Notch1扩增引物：F: ATGACTGCCCAGGAAACAAC，R:GTCCAGCCATTG-ACACACAC。扩增步骤按照两步法：94 ℃ 30s预变性，循环1次；95 ℃ 5 s变性，60 ℃ 30 s延伸，循环35次；72 ℃ 2 min绘制融解曲线。反应结束后按照Delta-delta Ct^[10]法计算各组Notch1 mRNA的表达。

治疗24 h后，迅速取各组大鼠缺血侧脑组织，用总蛋白提取试剂盒提取缺血灶周围蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度。蛋白定量配平后使用8% SDS-PAGE凝胶进行电泳，再电转至PVDF膜。转膜成功后用5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，随后孵育一抗Notch1(1: 500)、NICD(1: 200)、β-actin(1: 1 000)于4 ℃冰箱过夜。次日取出，用TBST漂洗后再4 ℃孵育二抗2 h。最后使用蛋白成像仪检测目的蛋白条带，及使用Fluorchem 8900灰度分析软件进行分析。

大鼠治疗24 h后，10%水合氯醛深度麻醉，经心脏灌注生理盐水及4%多聚甲醛，取出缺血侧脑组织并浸泡于4%多聚甲醛过夜，再用蔗糖溶液脱水，OCT包埋，作冠状位冰冻切片(10 μm)。实验前先用PBS漂洗，再5%BSA封闭30 min，随后孵育一抗Notch1(1: 100)、NICD(1: 100)于4 ℃冰箱过夜，次日孵育荧光二抗和Lectin(1: 100)2 h，使用抗荧光淬灭剂封片后，随机取5个视野于免疫荧光显微镜下阅片。

所有数据使用统计学软件SPSS 13.0进行分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，RT-PCR及Western blot数据多组间较分析时采用one-way ANOVA方差分析，两两比较采用LSD-t检验方法分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

由图 1、2可见，假手术组小胶质细胞呈分枝状，Notch1及NICD几乎不表达于小胶质细胞；缺血损伤后，小胶质细胞呈圆形或阿米巴形，脑缺血组与NS组Notch1及NICD在小胶质细胞上的表达明显增加；10%HS治疗后，Notch1及NICD在小胶质细胞上的表达明显减少。

A、D、G、J代表相应各组Lectin标记的小胶质细胞的表达情况，B、E、H、K分别表示假手术组、脑缺血组、生理盐水组、高渗盐水组Notch1的表达情况，C、F、I、L表示各组Lectin和Notch1的共定位表达情况。水平标尺：20 μm 图 1 免疫荧光显示各组Lectin和Notch1的共定位表达 Co-localization of Lectin and Notch1 in each group by immunofluorescence Fig 1

图选项

A、D、G、J代表相应各组Lectin标记的小胶质细胞的表达情况，B、E、H、K分别表示假手术组、脑缺血组、生理盐水组、高渗盐水组NICD的表达情况，C、F、I、L表示各组Lectin和NICD的共定位表达情况。水平标尺A-L，20 μm 图 2 免疫荧光图像显示各组Lectin和NICD的共定位表达 Fig 2 Co-localization of Lectin and NICD in each group by immunofluorescence

图选项

与假手术组比较，aP<0.01;与脑缺血组比较，bP<0.01;与生理盐水组比较，cP<0.05 图 3 各组Notch1 mRNA的表达水平 Fig 3 Comparison of Notch1 mRNA expression between groups

图选项

与假手术比较，aP<0.01，与脑缺血组比较，bP<0.05 图 4 Western blot检测各组Notch1与NICD蛋白表达 Fig 4 Levels of Notch1 protein and NICD protein measured by Western blot

图选项

各组脑缺血灶周围Notch1 mRNA的相对表达分别为：对照组1.000±0.076；脑缺血组2.203±0.283；NS组1.616±0.185；HS组1.202±0.177；与假手术组比较，脑缺血组与NS组Notch1 mRNA的表达明显增加(P<0.01)；此外，与脑缺血组比较，NS组Notch1 mRNA的表达均明显减少(P<0.01)；与脑缺血组及NS组比较，10%HS组Notch1 mRNA的表达均明显减少(P<0.05)。

各组脑缺血灶周围Notch1蛋白相对表达为：对照组0.290±0.079；脑缺血组0.750±0.029；NS组0.765±0.182；HS组0.390±0.195。脑缺血组和NS组大鼠脑缺血灶周围Notch1蛋白表达比对照组明显增加(P<0.01)；10%HS治疗后，Notch1蛋白表达较脑缺血组和NS组明显减少(P<0.05)。各组脑缺血灶周围NICD蛋白相对表达为：0.401±0.196；脑缺血组：0.906±0.359；NS组：0.847±0.153；HS组：0.561±0.165。脑缺血组和NS组大鼠脑缺血灶周围NICD蛋白表达比对照组明显增加(P<0.01)；10%HS治疗后，NICD蛋白表达较脑缺血组和NS组明显减少(P<0.05)。

小胶质细胞被认为是中枢神经系统内主要的免疫细胞，脑缺血灶周围有大量激活的小胶质细胞参与神经炎症反应；在生理情况下，小胶质细胞呈分枝状，当受到急、慢性刺激后，小胶质细胞被激活，变成圆形或阿米巴形，并释放产生大量IL-1β、TNF-α、ROS、IL-6、iNOS等炎症介质等加重脑组织损害^{[4, 5, 6]}。在本研究中，正常对照组小胶质细胞呈分枝状，而脑缺血后，小胶质细胞呈圆形或阿米巴形；提示脑缺血可激活小胶质细胞。

Notch信号通路在免疫细胞应答外界刺激和感染中具有重要作用^{[11, 12, 13]}。它是一条广泛存在于动物体内，高度保守的信号通路^[14]。当Notch受体与配体结合时，Notch信号通路被激活，随后Notch受体经过两次蛋白酶水解作用释放出Notch蛋白的胞内片段——NICD，NICD再入核调控下游目的蛋白的表达^{[15, 16]}。因此，NICD也可以作为Notch信号通路激活的标志^[17]。小胶质细胞作为中枢神经系统中主要的免疫细胞，其Notch信号通路在中枢神经系统免疫应答中扮演重要角色。本研究结果显示未激活的小胶质细胞几乎不表达Notch1与NICD；当脑缺血后，小胶质细胞被激活，小胶质细胞上表达的Notch1与NICD也明显增加，表明Notch信号通路与小胶质细胞激活密切相关，这与Grandbarbe等^[18]用LPS诱导小胶质细胞激活后，细胞表面Notch1表达明显上调的研究结果一致。此外也有研究表明阻断Notch信号通路可减少激活的小胶质细胞数量^[3]。

当中枢神经系统损伤时，Notch信号通路可被激活^[19]并加重脑缺血后损伤^[20]。本研究通过RT-PCR及Western Blot实验方法同样表明，脑缺血后脑缺血组和生理盐水组缺血灶周围Notch1 mRNA表达明显增加，Notch1及NICD的蛋白表达也明显增加；表明脑缺血后Notch信号通路被激活。有研究表明脑缺血后Notch1、NICD表达明显上调，阻断Notch信号通路可明显减少神经元凋亡、减少激活的小胶质细胞数量，减少炎症介质IL-6、IL-1β、iNOS、M-CSF的释放以及降低脑梗死面积，提高神经行为功能^{[3, 20, 21]}。

长期以来渗透性治疗都是颅内压增高的主要治疗方法^[22]；高渗盐水是指南推荐治疗脑水肿的渗透性药物^[1]，广泛应用于脑水肿颅内高压的患者^[23]。有研究表明高渗盐水具有神经保护作用并能降低脑梗死患者的病死^{[24, 25]}。本课题组前期研究^{[7, 8]}表明高渗盐水可降低脑缺血大鼠的脑梗死面积，减少小胶质细胞释放炎症介质IL-1β、TNF-α、MCP-1。故本研究进一步探索高渗盐水是否通过Notch信号通路来发挥抑制炎症介质的作用，结果显示脑缺血大鼠经高渗盐水治疗后Notch1 mRNA表达下降，脑缺血周围Notch1及NICD蛋白表达下降，脑缺血灶周围小胶质细胞上Notch1及NICD表达明显下降，表明高渗盐水可抑制脑缺血后小胶质细胞上Notch信号通路的激活。这可能是高渗盐水减轻脑损伤的机制之一。

但高渗盐水调控Notch信号通路的具体机制还不是很清楚。研究表明高渗盐水能够调节免疫细胞，抑制巨噬细胞的活化及中性粒细胞的迁移，减炎症因子的释放^{[26, 27, 28]}。NF-κB是调控炎症因子的经典信号通路，有研究发现^[29]高渗盐水可抑制I-κBα的磷酸化，抑制NF-κB的核转移及其调控作用。而NF-κB可以调控Notch信号通路，阻断NF-κB可明显减少Notch1、NICD的表达^[30]。提示高渗盐水对Notch信号通路的抑制作用可能是通过NF-κB发挥作用。