2015, Vol. 24
东南大学附属中大医院重症医学科 (张朋书、徐静媛、杨毅、邱海波)
急性肺损伤 (acute lung injury,ALI) 及其严重形式急性呼吸窘迫综合征 (acute respiratory distress syndrome,ARDS) 是严重感染、创伤、休克等导致的急性难治性呼吸衰竭。全身性感染(sepsis)是ALI最常见的原因，占ALI病因50%以上[1]。近年来，尽管呼吸支持治疗取得长足进步，但是ALI病死率依然高达40%[2]。目前认为失控的肺部炎症反应是ALI发生发展的根本机制[3]。树突状细胞 (dendritic cell,DC) 是机体功能最为强大的抗原提呈细胞，具有独特的激发初次免疫应答的能力[4]。研究显示，肺常规DC在介导ALI肺炎症反应中发挥重要的作用[5]。DC在组织中接受抗原刺激后迁移至局部免疫器官如脾脏、淋巴结的T细胞区，启动免疫应答[6]。脾脏作为机体最大的外周免疫器官，有大量研究证实脾脏DC参与全身性感染的炎症激活和后期的免疫抑制[7, 8, 9, 10, 11]。然而，对于ALI时脾脏DC变化尚不清楚。本实验通过复制LPS-ALI小鼠模型，应用流式细胞术观察脾脏DC数量和功能状态，探讨ALI小鼠早期脾脏DC变化规律，为深入了解ALI的炎症反应机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物、试剂及实验分组 1.1.1 实验动物SPF级C57BL/6小鼠36只，雄性，6~8周龄，体质量18~22 g，由南京军区总医院实验动物中心提供。常规食水喂养并维持正常昼夜节律，稳定72 h后开始实验。本研究动物实验方案符合美国实验动物管理与使用指南的要求。
1.1.2 主要试剂和仪器LPS和胶原酶V购自Sigma-Aldrich公司。小鼠CD11c、CD11b、MHC Ⅱ、CD80及同型对照单克隆抗体购自eBioscience公司。小鼠IL-6 ELISA kit由上海依科赛生物有限公司提供。流式细胞仪为美国BD公司产品(BD FACSCaliburTM)。
1.1.3 实验分组C57BL/6小鼠称质量后，将36只C57BL/6小鼠随机(随机数字法)分为2组。① 对照组 (Con)：气管内滴入与LPS等体积的PBS；(2) ALI组 (ALI)：气管内滴入LPS 2 mg/kg复制LPS-ALI模型。后又按注射LPS或PBS 6、12、24 h三个时间点各分成3组，每组6只小鼠，至观察6、12、24 h后处死小鼠，留取脾待检。
1.2 ALI模型制备小鼠称质量，戊巴比妥钠 (50 mg/kg) 腹腔注射麻醉，仰卧固定于实验台，颈部皮肤消毒，切开皮肤，逐层分离皮下组织，暴露气管。气管内注入LPS 2 mg/kg (溶于30 μL PBS中，对照组注入等体积的PBS)，缝合切口。手术完毕后迅速将动物直立、旋转，使液体在肺内分布均匀。动物清醒后常规饲养。小鼠LPS-ALI模型建立成功标准：肺间质充血、水肿，肺泡间隔明显増宽，肺间质和肺泡腔内有大量炎细胞浸润、出血，大量肺泡萎陷[12]。
1.3 脾单细胞悬液制备小鼠处死，无菌打开腹腔，应用机械法并裂解红细胞将脾脏制成单细胞悬液[13]。
1.4 检测指标及方法 1.4.1 肺湿质量/体质量 (LW/BW) 测定处死小鼠后，留取肺组织。用吸水纸将肺组织表面水分吸尽并清除血渍后，称质量并计算肺组织LW/BW。
1.4.2 肺组织HE染色及肺损伤评分肺组织固定、石蜡包埋、HE染色，光镜下观察肺组织损伤程度，采用Smith法进行肺损伤半定量评分[14]。
1.4.3 ELISA检测肺组织IL-6质量浓度取右下肺组织制备肺组织匀浆，ELISA检测IL-6质量浓度严格按试剂盒说明书进行操作。
1.4.4 流式细胞仪检测脾DC数量及功能状态脾单细胞悬液在显微镜下行细胞计数，调整细胞数为1×106/mL，分别加入单克隆抗体FITC-CD11c，Percp-Cy5.5-CD11b，PE-MHC Ⅱ及APC-CD80，室温下避光孵育30 min，PBS洗涤后以1%多聚甲醛固定，4 ℃避光保存，24 h内上机检测。各样本均设相应的同型对照管作为阴性对照。样本应用流式细胞仪FACSCaliburTM (BD公司) 检测，用Cellquest软件(美国BD公司)分析数据。
参照文献[15, 16]以CD11c+CD11b+细胞占脾单细胞数量百分比反映脾DC数量。分析表面表达CD80、MHC Ⅱ的DC比例，反映DC功能状态和成熟程度。
1.5 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x± s )表示。两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差(LSD-t法)分析，方差不齐时采用Mann-Whitney U及Dunnett’s T3检验。以P <0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 ALI小鼠肺炎症损伤变化肺LW/BW反映肺炎症损伤程度[17]。ALI组小鼠6、12、24 h LW/BW均明显高于对照组相应时间点LW/BW (P <0.05)，但ALI组各时间点差异无统计学意义 (P>0.05)，见表 1。病理学检查显示对照组小鼠肺泡间隔均一，肺泡腔内未见明显渗出液及炎性细胞浸润；ALI组小鼠肺组织病理检查见肺泡间隔明显增宽、出血并有大量炎性细胞浸润，见图 1。Smith肺损伤评分可半定量评估ALI肺炎症损伤程度[14]。ALI组6、12、24 h肺组织病理损伤评分均明显高于对照组相应时间点的肺损伤评分 (P <0.05)，但ALI组各时间点差异无统计学意义 (P>0.05)，见表 1。ALI组6、12、24 h肺组织IL-6含量均明显高于对照组相应时间点肺组织IL-6水平 (P <0.01)；与ALI组6 h和24 h相比，ALI组12 h肺IL-6水平显著升高 (P < 0.01)。见表 2。
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| A：对照组；B：ALI组 图 1 ALI小鼠6 h肺组织病理改变 (HE × 100) Fig 1 Changes of lung histopathology before and after ALI at 6 h (HE × 100) |
| 组别 | LW/BW | F值 | P值 | Smith评分 | F值 | P值 | ||||
| 6 h | 12 h | 24 h | 6 h | 12 h | 24 h | |||||
| 注：与对照组比较，a P <0.05；LW/BW为肺湿质量/体质量 | ||||||||||
| 对照组 | 0.53±0.03 | 0.52±0.02 | 0.52±0.04 | 0.345 | 0.714 | 0.56±0.08 | 0.67±0.22 | 0.61±0.14 | 0.72 | 0.504 |
| ALI组 | 0.72±0.09a | 0.67±0.03a | 0.63±0.09a | 1.639 | 0.227 | 6.08±0.53a | 5.27±0.19a | 5.11±0.26a | 2.67 | 0.106 |
| t值 | 4.37 | 5.73 | 2.57 | 25.09 | 38.70 | 37.24 | ||||
| P值 | 0.001 | 0.000 | 0.028 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | ||||
| 组别 | IL-6 (pg/mg) | F值 | P值 | ||
| 6 h | 12 h | 24 h | |||
| 注：与对照组比较，aP < 0.01；与6 h和24 h ALI组比较，bP < 0.01 | |||||
| 对照组 | 393±91 | 335±168 | 345±112 | 0.43 | 0.656 |
| ALI组 | 2887±171a | 3447±431ab | 2923±231a | 6.57 | 0.009 |
| t值 | 32.29 | 16.69 | 24.97 | ||
| P值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | ||
对照组小鼠6、12、24 h脾DC分别为(1.12±0.37)%、(1.16±0.34)%和(1.14±0.15)%。 ALI小鼠6 h脾DC为(1.28±0.25)%，与对照组 差异无统计学意义 (P>0.05)；ALI 组12 h脾脏DC显著升高至 (1.92±0.25)%，明显高于对照组 (P <0.01)；ALI小鼠24 h脾DC降至 (0.96±0.21)%，与对照组差异无统计学意义 (P>0.05)。与ALI组6 h和24 h相比，ALI组12 h脾DC数量显著升高 (P <0.01)。见表 3和图 2A、B。
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| A：ALI小鼠脾脏DC数量变化流式细胞图；B：ALI小鼠脾脏DC数量变化；C：ALI小鼠脾脏DC表达CD80水平流式细胞图；D：ALI小鼠脾脏DC表达CD80变化；E：ALI小鼠脾脏DC表达MHCⅡ水平变化流式细胞图；F：ALI小鼠脾脏DC表达MHCⅡ水平变化； Isotype：同型对照；Con：对照组；ALI：急性肺损伤组；与对照组比较，a P < 0.05；与6 h ALI组比较，b P < 0.05 图 2 ALI小鼠脾DC数量及表达CD80、MHC Ⅱ变化 (n=6) Fig 2 Comparison of splenic DC, CD80 and MHC Ⅱ expression on splenic DC before and after ALI (n=6) |
| 组别 | 脾DC占脾单细胞比例(%) | F值 | P值 | ||
| 6 h | 12 h | 24 h | |||
| 注：与对照组比较，a P < 0.01；与6 h和24 h ALI组比较，b P < 0.01 | |||||
| 对照组 | 1.12±0.37 | 1.16±0.34 | 1.14±0.15 | 0.12 | 0.887 |
| ALI组 | 1.28±0.25 | 1.92±0.25ab | 0.96±0.21 | 20.25 | 0.000 |
| t值 | 0.78 | 3.95 | 0.81 | ||
| P值 | 0.456 | 0.004 | 0.439 | ||
对照组6、12、24 h 脾DC表达CD80分别为(9.0±3.6)%、(10.1±3.6)%和(11.3±3.5)%。ALI组相应时间点脾DC表达CD80分别为 (25.2±4.7)%、(36.6±6.2)%和(43.9±10.5)%，明显高于对照组 (P < 0.01)。与ALI组6 h相比，ALI组12 h和24 h脾脏DC表达CD80显著升高 (P <0.05)；但ALI组12 h和24 h脾脏DC表达CD80水平差异无统计学意义 (P>0.05)。见表 4和图 2C、2D。
| 组别 | 脾DC表达CD80比例(%) | F值 | P值 | 脾DC表达MHC Ⅱ比例(%) | F值 | P值 | ||||
| 6 h | 12 h | 24 h | 6 h | 12 h | 24 h | |||||
| 注：与对照组比较，a P < 0.01；与6 h ALI组比较，b P < 0.05 | ||||||||||
| 对照组 | 9.0±3.6 | 10.1±3.6 | 11.3±3.5 | 0.495 | 0.622 | 84.9±8.6 | 85.4±1.8 | 82.2±6.6 | 0.47 | 0.635 |
| ALI组 | 25.2±4.7a | 36.6±6.2ab | 43.9±10.5ab | 7.738 | 0.007 | 88.9±1.5 | 89.0±4.0 | 86.5±9.5 | 0.28 | 0.758 |
| t值 | 6.08 | 8.15 | 6.15 | 0.76 | 1.05 | 0.89 | ||||
| P值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.470 | 0.353 | 0.401 | ||||
对照组6 h、12 h和24 h脾DC表达MHC Ⅱ分别为 (84.9±8.6)%、(85.4±1.8)%和(82.2±6.6)%；ALI组小鼠相应时间点脾DC表达MHC Ⅱ 分别为 (88.9±1.5)%、(89.0±4.0)%和(86.5±9.5)%，与对照组差异无统计学意义 (P>0.05)；ALI组各时间点脾DC表达MHC Ⅱ水平亦差异无统计学意义 (P>0.05)。见表 4和图 2E、F。
3 讨论ALI是感染、创伤和休克等导致的急性难治性呼吸衰竭，病死率高[1]。目前认为失控的炎症反应是其发生的根本原因[3]。DC是功能最强大的专职抗原提呈细胞，广泛分布于机体各组织，在启动和调节免疫应答反应中发挥关键性作用[4]。小鼠DC通过诱导T、B、NK等调控免疫应答，并通过释放细胞因子调节免疫反应的强度和时程[18]。近期研究证实，肺DC在介导ALI肺炎症反应中发挥重要的作用[5]。而脾脏作为机体最大的外周免疫器官，是发挥免疫应答效应的重要场所，其细胞组成、免疫调理因子的变化对机体整体免疫状态起重要的调节作用[16]。研究ALI脾DC状态有助于阐明ALI致病机制。
本研究利用气管内注射LPS (2 mg/kg) 复制小鼠ALI模型，模拟肺部感染导致ALI的临床过程。结果显示，LPS注射后，小鼠肺组织LW/BW显著升高，肺组织病理可见肺泡间隔增宽和肺泡间质内血管充血、出血及大量炎细胞渗出等ALI病理变化，Smith评分也显示小鼠肺损伤评分显著高于对照组，肺组织IL-6显著升高，证实小鼠ALI模型复制成功。
本实验应用流式细胞仪检测脾单细胞悬液，结果发现从正常小鼠的脾脏分离出来的DC占1%左右，与既往研究结果基本一致[16]。本研究结果显示，ALI小鼠脾脏DC呈一过性升高，12 h达高峰，24 h恢复基线水平。有研究显示，小鼠静脉注射LPS后，淋巴结中DC的数量在6 h内明显升高，12~24 h达高峰，峰值较正常升高8~15倍，随后DC大量凋亡而降至低于正常水平[19]。另有实验利用全身性感染小鼠模型，发现脾脏DC数量明显增加，36 h达高峰，然而48 h脾脏DC数量明显减少，推测是免疫系统自身“负反馈”[20]。本实验结果提示ALI小鼠脾脏DC与全身性感染小鼠变化趋势基本一致，在12~36 h呈现峰值，随后降至正常或更低水平。略有不同的是，本研究观察到ALI 小鼠脾脏DC在12 h达峰值，似略早于全身性感染小鼠 (12~36 h)，原因尚不清楚，可能与不同模型选择、免疫反应方式不全相同等因素有关。
DC成熟状态也决定机体发生免疫反应的类型和程度。未成熟DC诱导免疫激活的能力很弱，成熟的DC具有诱导免疫激活T细胞的功能，改变DC的表型和功能将影响机体的免疫应答反应。笔者通过检测DC表达CD80水平反映DC功能状态和成熟程度，检测DC表达MHC Ⅱ反映DCs抗原提呈功能和成熟状态[21]。
本研究发现尽管ALI小鼠脾脏DC数量仅一过性升高，但在各观察时间点脾脏表达CD80的DC均明显升高，且随观察时间延长进一步升高，表明成熟的DC增多，且呈时间依赖性，与全身性感染小鼠早期脾脏DC功能变化基本一致，该变化也与ALI早期机体炎症反应亢进过程相吻合[10, 11]。然而，ALI时表达MHC Ⅱ的脾脏DC差异无统计学意义，均近90%左右，表示在静息状态和炎症状态下脾脏DC均有较强的抗原提呈能力，ALI小鼠脾脏DC表达MHC Ⅱ差异无统计学意义，不排除可能与DC高表达MHC Ⅱ有关。
总之，本研究发现ALI小鼠脾脏DC呈一过性增加，伴功能呈成熟状态。脾脏DC可能参与ALI发生发展，而以脾脏DC为靶点调控ALI病程可能具有新的防治前景。
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