脓毒症(sepsis)是感染、烧伤、创伤、外科手术、中毒及心肺复苏术后常见的并发症，其病死率仍高达30%~70%，发生率仍以每年1.5%~8.0%的速度上升^{[1, 2]}。脓毒症发生发展时，常伴有免疫紊乱，宿主的免疫功能状态在很大程度上决定着感染引发的全身炎症反应患者的结局。免疫紊乱主要表现为T淋巴细胞亚群的功能紊乱，而作为成熟的T细胞亚群，调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)具有抑制性和无反应性免疫学特征，几乎参与了机体对所有病原体和自身抗原的免疫反应^{[3, 4]}。CD4⁺CD25⁺Treg细胞是调节性T细胞的重要亚群，目前已证实经T细胞受体(T cell receptor,TCR)介导的信号刺激活化以后可抑制效应T细胞(effective T cell,Teff)的增殖、激活以及B细胞产生免疫球蛋白^{[5, 6]}，抑制机体过度的炎症反应。目前国内外的研究多集中在其具体信号通路的研究上，对于其在临床预后预测的方面研究较少。为此，笔者观察了临床确诊脓毒症患者外周血中CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例变化与预后的相关性，为其临床应用提供新的线索。

本研究属观察性研究，收集长征医院2013年12月至2014年4月入院临床确诊脓毒症患者。入组患者均严格按照急性生理和慢性健康状况评分系统Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)与器官功能序贯衰竭评分(sequential organ failure assessment,SOFA)评分，血样本入组即刻抽取，并行流式细胞检测，其余相关指标取每日监测最差值。

纳入标准依据2001年危重症学会、欧洲危重病学会、美国胸科医师协会、美国胸科协会、外科感染协会关于全身性感染定义国际会议所制定的标准(ACCP,SCCM2001)。已有明确感染；符合以下任意两项及以上：①体温大于38 ℃或小于36 ℃，②心率大于90次/min，③呼吸频率＞30次/min，或PaCO₂＜32 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，④外周WBC＞12×10⁹/L或＜4.0×10⁹/L，或未成熟粒细胞＞10%。

排除标准：年龄小于18岁；癫痫病史；自身免疫疾病；长期服用免疫抑制剂；伴有活动性出血；急性左心衰致肺水肿。

分别于第1天及第7天采集外周静脉血，肝素抗凝用于分离淋巴细胞进行流式细胞检测CD4⁺CD25⁺Treg比例，其余常规检测血常规、肝肾功、凝血、电解质及PCT、内毒素。取外周动脉血1 mL肝素抗凝行血气分析检查。1 d中如有多次检测，取其最差值。入ICU第1天常规送检病原学。

流式细胞术参照文献及说明书步骤进行，所有实验于采血后30 min内进行。以 FACS Canto (美国BD公司) 检测，BD FACSDiva软件分析数据。

数据采用SPSS 19.0(SPSS Corp,Chicago,IL,USA)软件分析。正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示，生存组、死亡组组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的计量资料采用中位数(四分位数)[M(P₂₅，P₇₅)]表示，组间采用Mann-Whitney U-Wilcoxon非参数检验。各项评分及CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例对患者预后的评价价值。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.1 入组患者一般情况

本研究纳入符合标准患者28例。年龄(60.36±15.03)岁，男性患者22例，ICU入住天数为23.50 d(12.25,31.75) d，APACHEⅡ评分(16.68±7.00),SOFA评分(7.18±3.78)；伴有严重创伤患者12例(42.9%)，感染性休克患者10例(35.7%)，死亡9例(32.2%)。感染来源主要为肺部17例，血流感染10例，腹腔来源4例，尿路来源3例，皮肤软组织2例，其他来源3例；病原以革兰氏阴性菌为主有22例患者检出，其次为真菌，有10例患者体液标本中检出真菌，见表 1。

生存组与死亡组相比，血常规、常规生化指标监测两组差异无统计学意义，反映凝血状功能的D-二聚体在监测的第7天，死亡组高于生存组，差异具有统计学意义(P＜0.05)；血小板第7天值死亡组明显低于生存组(P＜0.05)；感染标志物降钙素原，无论第1天值还是第7天值，死亡组均高于生存组(P＜0.05)；内毒素第7天值也显示了类似的结果，死亡组高于生存组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表 2。

在脓毒症诊治过程中，依据病情严重程度及早采取干预措施，很大程度上决定着患者的预后。为准确评估脓毒症患者的预后，目前提出了很多行之有效的评分标准，包括：APACHEⅡ评分、改良的早期预警评分(modified early warning score,MEWS)、SOFA评分等^[7]。这些基于生理变量的评分标准有着良好的预后预测准确性，但均未涉及机体免疫状态。

随着对脓毒症认识的深入，机体免疫反应成了脓毒症研究的热点^[8]。目前认识到，在脓毒症的发病过程中，机体并非处于一成不变的免疫激活状态，负向调控(negative regulation)机制在脓毒症的发生、发展过程中也发挥着重要作用^[9]。这其中最主要的外周细胞免疫反应调节途径就是CD4⁺CD25⁺Treg参与的调节。早期脓毒症患者的主要死亡原因在于过度激活的免疫系统释放大量的细胞因子，多器官系统的损伤都是由于细胞因子风暴(cytokine storm)造成^{[10, 11]}。在病程中后期，由于ADCC作用，又导致免疫低下，病原清除能力下降，致机体死亡^[4]，CD4⁺CD25⁺Treg能够抑制效应T细胞的激活。目前的研究集中在CD4⁺CD25⁺Treg的调控机制，临床应用研究较少。加之目前的评分系统未涉及免疫调节，因此探讨外周血CD4⁺CD25⁺Treg比例与预后的相关关系，可视为临床应用免疫调理诊治脓毒症的第一步。

本研究中生存组、死亡组组间第1天外周血CD4⁺CD25⁺Treg中位数为2.10%(0.80,3.10)%vs.1.80%(1.15,3.65)%差异无统计学意义。经过一周的ICU治疗，第7天的两组外周血CD4⁺CD25⁺Treg中位数为：0.90%(0.30,2.80)%vs.5.70%(2.60,8.30)%，Z=-2.905，P=0.004，死亡组明显高于生存组，两组间差值Δ_Treg(d7-d1)中位数为：-0.40%(-1.70,-0.10)%vs. 1.90%(1.55,5.10)%，Z=-3.351，P=0.01,死亡组明显高于生存组，差异具有统计学意义。造成这一现象的可能原因在于因创伤、感染等各种因素混杂，加之患者免疫激活程度的差异，使得入组时免疫状态存在差异，而第7天与第1天的差值，反映的是患者一周内的免疫功能变化情况，这一变化情况能够反映患者的免疫状况，因而在两组间存在差异。就本组样本而言CD4⁺CD25⁺Treg_d7与Δ_Treg(d7-d1)在两组间差异均有统计学意义，均可考虑用于脓毒症预后预测。

另外，本研究也发现降钙素原在生存组与死亡组间存在差异，第1天两组间PCT中位数为1.84 ng/mL(0.39,6.28)ng/mL vs.8.47 ng/mL(5.59,14.15)ng/mL,Z=-2.730，P=0.006；第7天为0.74 ng/mL(0.21,2.00)ng/mL vs. 8.10 ng/mL(4.42,9.27)ng/mL,Z=-3.424，P=0.01，差异有统计学意义。国内有学者^[12]引入了PCT清除率的概念，以血清PCT差异评估患者预后，得出了动态变化水平比PCT的绝对值更有意义^[13]。本研究得出的结论与之相仿，同样的感染标志物内毒素第7天值中位数在两组间也存在差异0.1240 EU/mL(0.0443,0.2320)EU/mL vs. 0.4813 EU/mL(0.2387,0.7412)EU/mL,Z=-2.583,P=0.010,同样差异具有统计学意义，与目前文献报道一致^[14]。反映凝血的指标D-二聚体、血小板PLT在入组时两组间差异无统计学意义，而第7天显示具有差异，提示了这些指标在脓毒症预后评价中的价值^{[15, 16, 17]}，同时也提示动态监测各指标在诊治过程中的重要意义。

本研究的不足之处在于：首先，纳入病例数较少；其次，本研究纳入病例不包括普通病房收治的、病情相对较轻的脓毒症患者，本研究纳入患者APACHEⅡ评分、SOFA评分相对较高(16.68±7.00)和(7.18±3.78)；此外本研究为单中心研究，但可作为多中心、大样本研究的参考。

在此项研究中，脓毒症患者外周血CD4⁺CD25⁺Treg比例变化情况与患者病死率相关，对于脓毒症患者而言，一周间外周血CD4⁺CD25⁺Treg比例差值可以准确评估不良预后，差值大于1.15%往往提示预后不良。