中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (1): 51-54
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魏明,刘佳,涂玲,梁颖红,龚艳杰,张宜花. 重症胰腺炎肺损伤大鼠磷脂酰肌醇-3激酶表达及其抑制剂对肿瘤坏死因子-α表达的影响[J]. 中华急诊医学杂志, 2015, 24(1): 51-54.
重症胰腺炎肺损伤大鼠磷脂酰肌醇-3激酶表达及其抑制剂对肿瘤坏死因子-α表达的影响
魏明 , 刘佳, 涂玲, 梁颖红, 龚艳杰, 张宜花     
450052 郑州，郑州大学第五附属医院检验科
收稿日期:2014-06-21
通信作者：魏明，Email：gushiweiming@126.com

急性肺损伤(ALI)是重症急性胰腺炎(SAP)常见且严重的并发症之一，若不及时干预将进一步发展成急性呼吸窘迫综合征(ARDS)[1]。目前研究结果显示ALI是一种介质病，中性粒细胞的活化、浸润及大量炎症介质的释放，可造成肺组织及其毛细血管的损伤，从而使肺损伤加重[2, 3, 4]。已有研究显示磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)通路在中性粒细胞的活化过程中起重要作用[5, 6]，而沃特曼青霉素(Wortmannin)是PI3K的抑制剂，关于它能否减轻SAP时肺组织的损伤，目前报道尚少。我们通过建立大鼠SAP-ALI模型，观察SAP时PI3K/PKB通路活性变化，并应用Wortmannin来阻断该通路之后观察肺损伤的变化，探讨Wortmannin能否对SAP时肺组织损伤起到保护作用。

1 材料与方法 1.1 动物分组与SAP-ALI模型的建立

健康成年雄性SD大鼠70只(购自郑州大学实验动物中心)，体质量320～360 g，随机(随机数字法)分成假手术(SO)组(n=10)、SAP组(n=30)、SAP+Wortmannin(SAP+W)组(n=30)；SAP组与SAP+W组再分为3、6、12 h 3个亚组，每组各10只。大鼠术前12 h禁食，自由饮水，常规麻醉消毒铺巾，经上腹正中切口进腹，采用外径0.75 mm BD针于十二指肠外侧壁戳入肠管内，拔出针心，沿乳头方向探入胆胰管1.0～1.5 cm，以0.2 mL/min的速度向胰胆管内匀速注入4％牛磺胆酸钠(0.1 mL/100 g，购自Sigma公司)构建模型。SAP+W组于造模前2 h腹腔注射Wortmannin 1.4 mg/kg，SAP组与SO组均于造模前用同样方法给予等量对应溶剂(生理盐水)。SO组除开腹后仅翻动肠管外，其余操作同SAP组。SAP组、SAP+W组术后3、6、12 h活杀取材，SO组于12 h活杀取材。

1.2 大鼠肺含水率检测及病理学观察 取右下肺叶，滤纸吸干表面渗液及血迹，称湿质量后，置于80 ℃的烤箱中烘烤48 h至恒重，称干质量，计算肺含水率(%)=(湿质量-干质量)/干质量×100％。常规制作石蜡切片并苏木素-伊红(HE)染色。采用Schmidt[7]及Mayer等[8]评分标准对胰、肺组织进行病损严重度分析。 1.3 大鼠肺髓过氧化物酶(MPO)活性测定

称取一定量肺组织制备组织匀浆，严格按照试剂盒(南京建成生物试剂公司)说明书操作。

1.4 大鼠肺组织肿瘤坏死因子(TNF)-α检测

采用免疫组织化学法，兔抗大鼠单克隆抗体由Cell Sig-naling Technology公司提供。每只大鼠选3张结构完整的切片，在100倍显微镜下观察，用OlympusDE70CCD采集图像，阳性标准：肺泡上皮皮细胞和血管上皮细胞胞质出现棕黄色或核内有棕黄色颗粒。应用Image-pro plus 6.0免疫组织化学彩色图像分析系统对免疫组织化学结果进行定量分析，以图片中的1个阳性点(单个细胞或细胞团)为基础，分析测定整幅图片的阳性点个数、面积、积分吸光度值(IA)等参数。

1.5 Western blot法检测大鼠肺组织中PKB和p-PKB的表达

取肺组织约0.5 mg，置于组织匀浆器中，加入1 mL总蛋白提取液后冰浴下超声匀浆，提取总蛋白，采用内参照法行总蛋白定量。取25 μL/孔，行12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳2 h，然后转至硝酸纤维素(NC)膜上，加入兔抗鼠PKB(1∶ 400稀释)和兔抗鼠p-PKB单克隆抗体(1∶ 1000稀释)，4 ℃过夜；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶ 40 000稀释)；增强化学发光(ECL)法显示结果，X线片曝光显影，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照。采用Gelpro 4.0版凝胶吸光度分析软件以及Image-pro plus 6.0软件分析结果，以相应条带灰度值表示相对蛋白含量。

1.6 统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用成组t检验，相关性检验采用线性相关分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 大鼠肺含水率、肺MPO活性

SAP组各时间点肺含水率较SO组明显逐步升高(P<0.05)，肺MPO活性明显增强，呈逐步升高趋势(P<0.05)，SAP组12 h肺含水率、MPO活性达到峰值。而SAP+W各组指标较SO组也明显升高(P<0.05)，但与SAP各组比较明显下降(P<0.05)，见表 1。

表 1 各组大鼠肺含水率、MPO活性比较(x±s)
组别 3 h 6 h 12 h
肺含水率(%) MPO活性 肺含水率(%) MPO活性 肺含水率(%) MPO活性
SO组 — — — — 48.51±2.21 1.29±0.23
SAP组 63.24±1.32 3.79±0.35 77.71±2.31 8.54±0.34 83.73±2.36 13.24±0.32
SAP+W组 51.73±1.77 2.53±0.29 61.25±2.79 5.39±0.61 71.48±2.58 8.73±0.51
P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05
表选项
2.2 大鼠胰腺和肺病理学检查

SO组胰腺组织镜下结构未见明显异常。SAP各组胰腺组织出现不同程度出血、坏死、炎性细胞浸润，胰周组织脂肪坏死，且随造模时间延长逐渐加重；SAP+W各组胰腺也出现不同程度损伤，较SO组严重，但与SAP组比较有所好转。SO组大鼠肺组织镜下结构基本正常，SAP组3 h镜下见肺间质开始充血、水肿，肺间质及肺小血管周围多量炎性细胞浸润。SAP组6、12 h呈不同程度的肺泡和间质水肿、出血、灶性或片状肺不张，肺泡间隔进一步增宽，大量炎性细胞浸润，肺组织结构破坏等典型的ALI病理改变；SAP+W组各时点肺损伤情况较SAP组各时点有明显好转，见表 2、图 1。

表 2 大鼠胰、肺病理评分比较(x±s)
组别 胰腺组织学评分 肺组织学评分
3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h
SAP组 7.68±0.45 10.73±0.29 12.58±0.67 5.24±0.32 5.73±0.29 6.51±0.26
SAP+W组 5.64±0.61 8.78±0.58 9.75±0.57 3.01±0.42 4.03±0.45 5.05±0.33
P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05
表选项
图 1 6 h时SAP组大鼠胰腺组织(A)和肺组织(B)结构 (HE×400)
图选项
2.3 大鼠肺TNF-α染色面积和IA值

SO组肺泡上皮细胞和血管内皮细胞表面均无明显染色，TNF-α的表达为阴性。SAP组术后3 h部分血管内皮细胞表面有黄褐色颗粒出现，6 h血管内皮细胞及肺泡上皮细胞表面均见黄褐色颗粒，12 h肺组织血管内皮细胞表面有多量黄褐色或棕黄色颗粒，肺泡上皮细胞可见浓聚黄褐色颗粒。SAP+W组肺组织TNF-α表达较SAP组有所下降。应用IPP免疫组织化学图像分析系统分析示，SAP各组其阳性染色面积、A值逐步升高，提示肺TNF-α的表达随SAP发病的推移逐步增强，与SO组比较差异有统计学意义(P<0.05)，SAP+W组较SO组增强(P<0.05)，但较SAP组好转(P<0.05)，见表 3、图 2。

表 3 各组大鼠肺TNF-α染色面积和TNF-α IA值比较(x±s)
组别 3 h 6 h 12 h
染色面积 IA值 染色面积 IA值 染色面积 IA值
SO组 — — — — 148.51±20.21 18.67±5.28
SAP组 363.23±35.32 35.79±8.35 770.71±158.31 68.54±9.34 1527.73±322.36 153.24±35.32
SAP+W组 308.73±40.77 26.53±9.29 621.25±167.79 50.39±9.61 1171.48±336.58 110.73±36.51
P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05
表选项
图 2 6 h时SAP组肺组织TNF-α表达(免疫组化×400)
图选项
2.4 大鼠肺p-PKB活性Western blot法检测

SO组PKB磷酸化水平最低，SAP组在造模后PKB磷酸化迅速升高，较SO组明显增加(P<0.05)，SAP+W组在给予药物抑制PI3K/PKB通路后，随发病时间推移PKB磷酸化水平逐步升高，与对照组比较仍较高(P<0.05)，但较SAP组明显降低(P<0.05)，见表 4、图 3。

表 4 Western blot法检测各组大鼠肺p-PKB活性比较(x±s)
组别 3 h 6 h 12 h
SO组 — — 183.67±41.48
SAP组 390.28±31.32 513.78±31.67 598.36±36.51
SAP+W组 267.73±37.56 361.28±33.87 389.73±42.38
P值 <0.05 <0.05 <0.05
表选项
A：SO组；B：SAP+W组；C：SAP组 图 3 各组肺组织P13K、PKB mRNA PCR扩增产物电泳分离凝胶成像(12 h)
图选项
3 讨论

ALI是SAP最常见并发症，当肺损伤发生时大量的炎性细胞迁移到肺部，并释放大量炎症介质，对肺毛细血管上皮及肺泡上皮造成损害，引起肺水肿及肺不张，病情严重者会造成ARDS[9, 10]。PI3K存在于细胞中，生物学作用广泛，研究结果显示在炎症时它可以被多种炎性因子激活，参与信号转导；而PKB是位于PI3K下游的一种重要蛋白酶，与PI3K关系密切。当PI3K被炎性因子激活后，可以将PtdIns(4，5)P2转变成第二信使PtdIns(3，4，5)P3(也称PIP3)，PIP3可以和PKB的PH结构域结合，使PKB磷酸化，进一步引起细胞核内靶基因的变化，从而调控中性粒细胞活化、迁移及炎性因子的表达，故PKB的磷酸化可以作为衡量PI3K活性的指标[11]。有研究结果显示，SAP时肺组织中的PI3K/PKB活性增强，与中性粒细胞的浸润及肺组织的损伤程度一致[12]。说明该通路在介导中性粒细胞活化加重肺损伤的过程中起重要作用。本实验结果显示，各组大鼠肺组织中PKB表达丰富，但PKB磷酸化程度不一，SO组大鼠肺组织中PKB的磷酸化程度低，SAP各组大鼠肺组织中的PKB磷酸化程度明显增加，且随时间推移逐渐升高，12 h达高峰。由此可见，SAP时PI3K通路逐渐被激活，活化后的PI3K可促使PKB磷酸化加强，进一步使PKB从细胞质转移到细胞膜并获得催化活性，从而完成炎性因子介导的信号转导过程[13]。同时，与SO组比较，SAP各组MPO、TNF-α的表达显著升高，且与PKB的磷酸化水平在动态变化上保持一致。该结果提示SAP发生时，PI3K/PKB通路被激活，从而介导大量中性粒细胞活化，肺组织中MPO活性明显升高，提示大量中性粒细胞在肺组织中浸润，加重炎症反应[14]。

由肺含水率、肺组织病理改变，可见随病程进展，肺水肿、肺不张等肺损伤程度越重，提示PI3K/PKB通路在SAP-ALI的发病中起重要作用。而在给予PI3K阻滞剂Wortmannin之后，PKB的磷酸化水平SAP+W组较SAP组明显降低，肺组织MPO、TNF-α变化也明显减低，肺含水率及肺病理损伤也有所好转，表明在PI3K被阻滞以后PKB的磷酸化受到抑制，其活性降低，从而减轻中性粒细胞的活化、迁移，减轻肺水肿及肺不张的程度，使肺损伤得到明显缓解，进一步表明Wortmannin对肺组织起到一定的保护作用。

总之，PI3K/PKB信号通路过度激活是SAP时肺损伤发生的重要步骤，其激活后可以介导大量PMN向肺组织浸润并释放炎症介质，加重肺损伤；其作用可能是SAP并发急性肺损伤中重要的发病机制之一。而Wortmannin通过抑制PI3K通路活性来阻断细胞内信号的传导，减轻炎症反应，使肺组织得到保护。由于ALI的发病是一个多信号通路多炎性因子参与的由轻到重的连续过程，若能进一步研究各个信号通路之间的交互关系，早期安全有效地抑制这些通路活性将有利于控制ALI的进一步恶化，这将对临床上治疗及控制胰腺炎肺损伤的发展有重要意义，值得进一步探讨。

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