2024, Vol. 33
2. 江苏大学医学院实验中心，镇江 212013
2. Department of experiment center, School of Medicine Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China
百草枯（paraquat，PQ）是一种有机杂环类除草剂，毒性强，致死剂量低。我国每年有大量中毒患者，口服致死率高达90%[1-2]。PQ可经消化道、呼吸道、皮肤吸收而造成多脏器多器官功能衰竭，临床尚无特效治疗手段，社会负担沉重。肺部是其主要靶器官，肺上皮细胞摄取并蓄积PQ，导致肺上皮细胞受损、凋亡及炎性细胞大量浸润，进而引发进行性肺纤维化和呼吸衰竭而死亡[3-4]。目前PQ致肺纤维化的分子机制尚未完全阐明，研究表明，上皮-间质转化（EMT）、炎症反应和氧化应激在PQ致肺纤维化中均发挥重要作用，其中Wnt/β-catenin[5-6]、PI3K/AKT[7]、Notch[8]和TGF-β/Smads[9]等信号通路参与介导EMT进程。此外，微小核糖核酸（miRNAs）亦可参与调控EMT和肺纤维化的发生发展[10-11]。研究发现，PQ诱导的肺纤维化中miRNAs的表达差异显著[12]，然而miRNAs在其中发挥的具体调控作用尚未明确。鉴于此，本研究通过体内外实验，探究miRNAs在PQ致肺纤维化中的生物学功能和分子机制，为PQ致肺损伤机制的阐明及干预靶点的选择提供理论基础和实验依据。
1 材料和方法 1.1 实验材料人支气管肺上皮细胞系（16HBE，美国ATCC细胞库）；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶-EDTA和双抗（100×Penicillin-Streptomycin）（美国Gibco）；miR-15a-5p模拟体（mimics）、嘌呤霉素和过表达miR-15a-5p慢病毒（上海吉凯基因科技有限公司）；百草枯试剂（美国Sigma）；RNeasy总RNA纯化Mini试剂盒（德国QIAGEN）；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；HisScriptⅡ QRT SuperMix for qPCR（上海科创达生物医药科技有限公司）；荧光素酶检测试剂盒（美国Promega）；Wnt3α、α SMA、Vimentin、CollagenⅠ、CK18、Occludin、β-catenin和GAPDH一抗（英国Abcam）；山羊抗兔二抗（美国Jackson Immuno Research）。
Thermo 3111型CO2细胞培养箱（美国Thermo）；K6600-C全波长酶标仪（北京凯奥科技发展有限公司）；A200基因扩增仪（杭州市朗基科学仪器有限公司）；LightCycler® 96实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche）；PowerPac HC Western blot电泳-转膜系统（美国Bio-Rad）；Tanon-5200全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养16HBE细胞使用DMEM完全培养基（含10%FBS，1%双抗）于CO2细胞培养箱（5%CO2，37℃）中培养。待细胞长至80%左右传代。根据实验目的进行分组处理，NC（normal control）组：正常对照，无特殊处理；PQ组：50 µmol/L的PQ处理细胞72 h；miR-15a-5p组：16HBE转染miR-15a-5p过表达慢病毒，使用1 µg/mL嘌呤霉素筛选构建的稳转株；miR-15a-5p+PQ组：50 µmol/L的PQ处理稳转株细胞72 h。
1.2.2 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）使用RNeasy总RNA纯化Mini试剂盒提取各组细胞的总RNA。使用HisScriptⅡ QRT SuperMix for qPCR试剂将总RNA逆转录成cDNA，使用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）进行miRNA第一链cDNA的合成。在LightCycler® 96 RT-qPCR系统中使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix以各组稀释后的cDNA为模板，以GAPDH或U6为内参进行qPCR，分析各组基因Ct值，2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达水平。引物由江苏赛索飞生物科技有限公司合成，引物序列见表 1。
| 引物名称 | 引物序列（5’→3’） |
| miR-15a-5p RT primer | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAA |
| miR-15a-5p Forward primer | CGCGTAGCAGCACATAATGG |
| miR-15a-5p Reverse primer | AGTGCAGGGTCCGAGGTATT |
| U6 RT primer | CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT |
| U6 Forward primer | GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT |
| U6 Reverse primer | CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT |
| β-catenin Forward primer | GGCTACTCAAGCTGATTTGATGG |
| β-catenin Reverse primer | GATGGTTCAGCCAAACGCTG |
| Collagen I Forward primer | TGGTGCTACTGGTGCTGC |
| Collagen I Reverse primer | CACCCTGGGGACCTTCAGAG |
| Vimentin Forward primer | GGACCAGCTAACCAACGACA |
| Vimentin Reverse primer | AAGGTCAAGACGTGCCAGAG |
| Occludin Forward primer | ACAGACTACACAACTGGCGG |
| Occludin Reverse primer | TTTGTGATGCTCACAGAGGT |
| CK18 Forward primer | CCTTTCTCTCTCCCCGGAC |
| CK18 Reverse primer | GTCGTTCAGGCTTTGCATGG |
| α-SMA Forward primer | CACGATGTACCCTGGGATCG |
| α-SMA Reverse primer | GCCGATCCACACCGAGTATT |
| Wnt3α Forward primer | ATGAACCGCCACAACAACGAGG |
| Wnt3α Reverse primer | GTCCTTGAGGAAGTCACCGATG |
| GAPDH Forward primer | GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG |
| GAPDH Reverse primer | ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA |
设计并合成miR-15a-5p mimics（成熟miRNAs模拟物，以双链形式合成，末端加入2个碱基TT悬垂用来模拟生理状态下的miRNAs）及阴性对照无义序列RNA（NC mimics）。将miR-15a-5p mimics或NC mimics与pMIR空载质粒或含靶点的荧光素酶报告基因重组质粒（pMIR-Wnt3α-WT）或含突变靶点的荧光素酶报告基因重组质粒（pMIR-Wnt3α-MT）两两共转染293T细胞，转染24 h后，使用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性，计算相对表达量。
1.2.4 蛋白印迹分析（Western blot，WB）使用RIPA裂解缓冲液制备各组蛋白样本，测定蛋白浓度。根据目的蛋白相对分子质量大小使用适宜浓度SDS-PAGE凝胶进行电泳分离蛋白，经转膜、封闭、一抗孵育和二抗孵育后使用化学发光法进行显影，采用ImageJ软件（1.42q，Way Rasband，National Institutes of Health，USA）分析蛋白条带灰度值。
1.2.5 肺纤维化动物模型实验选用6-8周龄雄性C57BL/6小鼠，经腹腔注射PQ 30mg/kg一次性染毒，对照组给予腹腔注射等量生理盐水。SPF级环境下饲喂，14 d后处死。取适量肺组织，4%多聚甲醛常温固定16 h。制作石蜡切片，苏木精-伊红（HE）染色，观察肺组织结构状况，免疫组织化学染色检测肺组织纤维化标记表达情况。
1.3 统计学方法实验数据采用SPSS 22.0软件和GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示。两组间数据比较采用独立样本t检验，P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 PQ诱导的肺上皮细胞中miRNAs表达情况构建PQ诱导的16HBE肺上皮细胞损伤模型，采用高通量miRNA芯片技术筛选细胞中表达差异明显的miRNAs。运用RT-qPCR技术对芯片筛选结果进行验证，发现10条差异表达的miRNAs。如图 1所示，与NC组相比，其中4条miRNAs（miR-4792、miR-572、miR-6068和miR-4322）显著上调，6条miRNAs（miR-29b-1-5p、miR-27b-5p、miR-15a-5p、miR-152-3p、miR-1260b和miR-4521)显著下调。
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| A：miRNA芯片检测表达改变的miRNAs；B：表达上调的miRNAs；C：表达下调的miRNAs。aP < 0.05，bP < 0.01 图 1 PQ诱导的人肺上皮细胞中miRNAs表达情况 Fig 1 The miRNAs expression in PQ-induced human lung epithelial cells |
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使用miRDB、RNAhybrid和DIANA TOOLS网站进行miR-15a-5p靶基因预测，选择与种子序列完全匹配，与EMT进程相关的基因Wnt3α进行研究。荧光素酶报告基因实验验证miRNA与靶基因之间的调控关系，如图 2所示，与NC组相比，pMIR-Wnt3α-WT型重组质粒与miR-15a-5p mimics共转染293T细胞后，其相对荧光素酶活性显著下降。pMIR-Wnt3α--MT型重组质粒组相对荧光素酶活性差异无统计学意义。表明miR-15a-5p可靶向结合Wnt3α的3’ UTR区域。
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| A：miR-15a-5p靶基因Wnt3α的结合位点及突变体设计；B：荧光素酶报告基因实验检测报告基因活性。aP < 0.01 图 2 miR-15a-5p靶基因的预测及验证 Fig 2 Prediction and verification of the target genes of miR-15a-5p |
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构建miR-15a-5p过表达的16hbe细胞稳转株，探究PQ对其基因表达的作用。采用RT-qPCR检测相关基因mRNA表达水平，如图 3A所示，与NC组相比，PQ可使Wnt通路相关基因Wnt3α和β-catenin、成纤维细胞标记基因Collagen I、Vimentin和α SMA的mRNA水平显著上调，上皮细胞标记基因Occludin和CK18的mRNA水平显著下调，miR-15a-5p组Wnt3α的mRNA水平显著下调，miR-15a-5p+PQ组各基因mRNA水平差异无统计学意义。采用Western blot检测其蛋白表达情况，如图 3B和3C所示，与nc组相比，PQ可使Wnt通路相关基因Wnt3α和β-catenin、纤维化标记基因Collagen I、Vimentin和α SMA的蛋白水平显著上调，上皮细胞标记基因Occludin和CK18的蛋白水平显著下调，miR-15a-5p组Wnt3α蛋白水平显著下调，miR-15a-5p+PQ组各基因蛋白水平差异无统计学意义。表明miR-15a-5p可调控Wnt3α/β-catenin信号通路从而改善PQ诱导的肺上皮细胞EMT转化。
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| A：RT-qPCR检测mRNA表达情况；B：Western blot检测蛋白表达水平；C：目的条带灰度值分析及统计。aP < 0.05，bP < 0.01，cP < 0.01 图 3 miR-15a-5p对PQ诱导的肺上皮细胞基因表达影响 Fig 3 The effect of miR-15a-5p on gene expression in PQ-induced lung epithelial cells |
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构建PQ诱导的肺纤维化小鼠模型，经气道给予miR-15a-5p过表达慢病毒，验证其对PQ导致的肺纤维化的影响。如图 4所示，与NC组相比，PQ组Wnt通路相关基因Wnt3α和β-catenin、纤维化标记基因Collagen I、Vimentin和α SMA的蛋白水平显著上调，miR-15a-5p组和miR-15a-5p+PQ组各基因蛋白水平差异无统计学意义。表明miR-15a-5p可通过调控Wnt3α/β-catenin信号通路，抑制PQ诱导的EMT进程。
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| A：Western blot检测相关蛋白表达水平；B：目的条带灰度值分析及统计。bP < 0.01，cP < 0.01 图 4 miR-15a-5p对小鼠肺组织蛋白表达的影响 Fig 4 The effect of miR-15a-5p on protein expression in the lung of mice |
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经气道滴注给予肺纤维化小鼠miR-15a-5p过表达慢病毒，采用HE染色和免疫组织化学检测肺损伤情况。如图 5A所示，miR-15a-5p可抑制PQ引起的肺组织结构紊乱、肺泡壁增厚和肺间质纤维化。如图 5B所示，与PQ组相比，miR-15a-5p可使纤维化标记蛋白Collagen I、Vimentin和α SMA表达下降，从而抑制PQ所致的肺纤维化发生发展，促进肺组织修复。
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| A：HE染色观察小鼠肺组织病理学结构，放大倍数：100x；B：免疫组织化学检测肺组织纤维化标记蛋白的表达情况，放大倍数：×200 图 5 miR-15a-5p对小鼠肺损伤的影响 Fig 5 The effect of miR-15a-5p on the lung injury in mice |
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PQ是一种联吡啶类除草剂。经呼吸道吸入、消化道和皮肤吸收后可对人体产生较强毒性，引起一系列并发症，包括急性呼吸窘迫、肺纤维化、肾功能衰竭、肝毒性等，口服致死率高达90%。临床针对PQ中毒尚无有效治疗措施，治愈率低，病死率高，给国家和人民带来沉重的社会和经济负担[2, 5]。肺部是PQ损害的主要靶器官，肺上皮细胞主动摄取并蓄积PQ，使肺组织内PQ浓度为血液浓度的10~90倍[13]，导致肺上皮细胞受损、凋亡及炎性细胞大量浸润，进而引发广泛的肺间质纤维化，患者最终因呼吸衰竭而死亡[14]。目前PQ致肺纤维化的分子机制尚未完全阐明，EMT、炎症反应和氧化应激在其中均发挥重要作用[15]，Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、Notch和TGF-β/Smad等信号通路均可参与肺纤维化进程[5-9]。本研究发现，PQ可使16HBE（人肺上皮细胞系）Collagen I、Vimentin和α SMA的mRNA和蛋白水平显著上调（a：P < 0.05），Occludin和CK18的mRNA和蛋白水平显著下调；动物实验发现PQ可显著上调肺组织中Collagen I、Vimentin和α SMA的蛋白水平HE染色和免疫组织化学提示PQ能够引起肺泡壁增厚，导致肺组织结构紊乱，造成肺损伤；提示PQ可诱导肺上皮细胞EMT发生，从而诱发肺纤维化。
miRNAs是存在于真核细胞中的一类内源性非编码单链小分子RNA，长约18-25个核苷酸（nucletide，nt），主要通过靶向靶基因mRNA的3’端非翻译区（3’ UTR）来调节靶基因表达，从而参与细胞分化、增殖、凋亡、组织损伤修复等生理病理进程[10, 16]。越来越多的研究表明miRNAs可参与上皮细胞EMT发生，在肺纤维化进程中发挥着重要的调控作用。Kuse等[11]发现外泌体来源的miRNA-22通过调节成纤维细胞向肌成纤维细胞分化进程以改善肺纤维化。Cao等[17]发现miR-200b/c可通过p38 MAPK和TGF-β/smad3信号通路靶向ZEB1/2，减轻脂多糖诱导的早期肺纤维化。Zhao等[12]在PQ诱导的小鼠肺泡上皮细胞（MLE-12）中，筛选出11条差异表达的miRNAs。本研究借助高通量芯片技术在PQ诱导的人肺上皮细胞损伤模型中筛选并验证出10条表达差异显著的miRNAs，选择显著下调的miR-15a-5p进行研究，发现miR-15a-5p可与Wnt3α基因3’ UTR区的碱基互补配对，负向调节Wnt3α基因的表达。
Wnt蛋白是一类分泌型糖蛋白，是Wnt/β-catenin信号通路的启动因子。不同的Wnt蛋白与膜上Fzd（Frizzled）家族受体结合，引起Axin-GSK-3β-APC复合物分解，促进β-catenin在胞质内大量积聚并入核，入核后结合转录因子TCF，调控下游靶基因的表达。Gao等[18]发现牛蒡子苷元可通过调控Wnt3α/β-catenin通路抑制PQ诱导的肺纤维化中的EMT进程。Ming等[19]发现PXR通过与p53相互作用抑制Wnt7a/β-catenin信号通路缓解肾纤维化。Yang等[20]发现抑制Wnt10b/β-catenin信号通路可减轻PQ诱导的肺纤维化。本研究发现，PQ导致miR-15a-5p表达水平显著下调，其靶基因Wnt3α表达水平显著上调，Wnt3α/β-catenin通路高度激活，促进肺上皮细胞EMT，最终导致肺纤维化。而过表达miR-15a-5p可抑制Wnt3α的表达，特异性降低Wnt3α/β-catenin信号通路活性，抑制EMT进程，最终有效抑制肺纤维化进程。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 王静、姬晓航：实验操作、论文撰写；王蒙蒙、张炜、冯靖：研究设计与实施指导；丁伟超、陈娟、孟健康：数据收集整理与统计分析；聂时南、孙兆瑞：研究设计、论文修改经费与技术支持
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