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新生鼠出血肺组织中内皮素-1、一氧化氮合成酶及丙二醛的水平与表达
原作者: 陈克正,高晓燕 文章来源: 中华急诊医学杂志 发布日期:2004-06-22
己证实外源性内皮素-1(exET-1)滴入新生鼠气管内,可成功制造肺出血(PH)模型,并发现随着exET-1浓度的增加,鼠肺从点状至弥漫性出血不断加重[1]

己证实外源性内皮素-1(exET-1)滴入新生鼠气管内,可成功制造肺出血(PH)模型,并发现随着exET-1浓度的增加,鼠肺从点状至弥漫性出血不断加重[1]。肺血管内皮细胞(PVEC)损伤是PH的病理基础[2],而内源性内皮素-1(enET-1)、一氧化氮(NO)及氧自由基(OFR)虽作用不同,但主要均由PVEC产生,且与急性缺氧有关。本研究采用可导致PH的、最佳浓度的exET-1[1]气管内滴入,在诱导出不同类型肺出血的同时,了解exET-1与enET-1的关系;测定肺组织中enET-1、可影响PVEC内NO合成的内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)及反映OFR代谢最终产物的丙二醛(MDA)的水平与表达,以探讨PH时三者之间的关系

材料与方法

一. 材料

二级新生Wistar大鼠50只(广州医学院实验动物中心),雌雄不限,日龄4~7d,体重8~10g。正常对照组10只,实验组40只,各组间日龄与体重无差异。

二.实验方法

1. 模型制作:①将接有水柱的小号套管针插至动物气管隆突上方。实验组于气管内滴入浓度为4×10-6mol/L 的exET-1 (Sigma公司)30μl,对照组滴入等量生理盐水。②注药3h后处死动物,观察双肺大体病理。③右肺用福尔马林固定,石蜡包埋后切片,HE染色。④肺脏大体病理及HE染色光鏡描述分Ⅰ~Ⅴ五级,即正常肺、肺水肿、点状PH、局灶性PH及弥漫性PH [3]

2. ET-1、eNOS免疫组化:①肺组织石蜡包埋后切片,分别用ET-1和eNOS抗体(美国Peninsula Lab)、链霉菌抗生物素蛋白免疫组化试剂盒(福建迈新公司)及二甲联苯胺显色剂,作ET-1及eNOS免疫组化染色玻片,每只大鼠各5张。②每张玻片随机选择10个视野,即每只大鼠ET-1及eNOS染色玻片各50个视野,用图像分析仪(E-mail2000型,广州亿鸣公司)观察,细胞显棕黄色至黄色为阳性。③统计每个视野阳性细胞数及全部细胞数,计算50个视野细胞总数并换算成阳性细胞数的百分比。将免疫组化强度分为-(阴性,阳性细胞<1% )、+(弱阳性,阳性细胞1%~33%)、++(阳性,阳性细胞34%~66%)、+++(强阳性,阳性细胞67%~100%)四个等级。

3. MDA含量测定:①左肺电子秤称重后,与冰冻生理盐水以1(g):9(ml)比例同置于冰盒中,组织匀浆器研磨,4℃离心3500转/分,持续15min。②用MDA测定试剂盒(南京建成生物工程研究所),经紫外/可见分光光度计(澳大利亚GBC公司Cintva20型)测定匀浆液MDA含量。

三、统计学处理


采用Ridit分析比较两组enET-1和eNOS免疫组化反应强度;Kendall相关分析了解病理分级与免疫组化反应强度的相关性;t检验比较两组MDA含量。数据用x± s表示,P<0.05,差异具有显著性。

结 果

1. 新生大鼠表现 实验组气管插管注入exET-1后,大鼠迅速出现紫绀、呼吸困难,34只存活大鼠约经0.5 h左右缓解,6只大鼠于注入exET-1后1.8±0.3 h内死亡。死亡大鼠紫绀无缓解,肺脏体积增大,呈灰白色,可见局灶性(2只)或弥漫性(4只)PH;对照组大鼠无异常。

2. 肺脏大体病理及HE染色光鏡结果:实验组肺水肿(Ⅱ级)20%(8/40),点状PH(Ⅲ级)25%(10/40),局灶性PH(Ⅳ级)25%(10/40),弥漫性PH(Ⅴ级)30%(12/40);对照组无异常(Ⅰ级)。

3. 免疫反应ET-1(irET-1)和eNOS(ireNOS)的表达:两者在支气管及肺泡上皮细胞、肺血管平滑肌细胞、尤为PVEC中均有阳性表达。随PH程度的加重:①irET-1阳性强度不断增加,阳性表达率亦不断上升(Ⅰ~Ⅴ级阳性表达率分别为30%、25%、80%、90%及100%)。Ridit分析,Ⅲ~Ⅴ级与Ⅰ级间及Ⅴ级与Ⅰ~Ⅲ级间比较,差异均有显著性(P<0.05)。Kendall相关分析提示,病理分级与irET-1阳性表达强度呈正相关(P<0.01,表1)。②ireNOS阳性强度不断减低,阳性表达率亦不断下降(Ⅰ~Ⅴ级阳性表达率分别为100%、100%、80%、70%及58.3%)。Ridit分析,Ⅲ~Ⅴ级与Ⅰ级间及Ⅴ级与Ⅰ~Ⅲ级间比较,差异均有显著性(P<0.05)。Kendall相关分析提示,病理分级与ireNOS阳性表达强度呈负相关(P<0.01,表2)


表1 肺组织irET-1表达强度

分组

大体病理分级

合计

-

+

++

+++


R±S
R


R 95% 可信限

对照组

10

7

3

0

0

0.2440±0

0.2440

实验组

8

6

1

1

0

0.2613±0.1990

0.1234~0.3992

 

10

2

4

4

0

0.4840±0.2074

0.3555~0.6125

 

10

1

3

4

2

0.6060±0.2345

0.4607~0.7513

 

12

0

1

4

7

0.7976±0.1546

0.7101~0.8851

注:1. Ridit分析:以5个组总计结果为标准组,R越大表示病理表现越重,各组R的95%可信限无重叠时表示差异有显著性(P<0.05)。

2. Kendall相关分析:相关系数为0.653,P<0.001。

表2 肺组织ireNOS表达强度

分组

大体病理分级

合计

-

+

++

+++


R±S
R

 


R 95% 可信限

对照组

10

0

1

1

8

0.7840±0

0.7840

实验组

8

0

2

2

4

0.6700±0.2256

0.5137~0.8263

 

10

2

3

4

1

0.4550±0.2462

0.3024~0.6076

 

10

3

4

2

1

0.3780±0.2528

0.2213~0.5347

 

12

5

5

2

0

0.2892±0.1916

0.1808~0.3976


注:1. Ridit分析:以5个组总计结果为标准组,R越大表示病理表现越轻,各组R 的95%可信限无重叠时表示差异有显著性(P<0.05)。

2. Kendall相关分析:相关系数为 -0.554,P<0.001。

4. 肺组织MDA含量比较:随着肺部病理从正常到弥漫性PH,肺组织中反映细胞脂质膜过氧化损害的MDA含量不断增加,Ⅳ、Ⅴ级与Ⅰ、Ⅱ级间及Ⅴ级与Ⅰ~Ⅲ级间比较,差异均有显著性(P<0.05,表3)。说明肺组织中MDA含量改变与PH程度呈正相关。

表3 肺组织MDA含量比较

实验分组

肺大体

病理分级

n

MDA(nmol/mgprot)

对照组

10

4.26± 0.42

实验组

8

4.32± 0.72

 

10

5.08± 0.75

 

10

5.44± 0.88(1)

 

12

6.14± 0.90(1,2)

(1):与Ⅰ、Ⅱ级比较 P<0.05; (2):与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级比较 P<0.05

讨 论

1. exET-1与enET-1的关系 enET-1主要由PVEC生成並释放,但在支气管上皮细胞中亦有少量表达。有报道哮喘患儿气道上皮细胞分泌的enET-1,是导致支气管痉挛及发生急性缺氧的原因之一[4];exET-1可引起大鼠发生急性缺氧而致肺组织enET-1水平升高[5]。本实验仅用30μl exET-1气管内滴入,大鼠即迅速出现紫绀与呼吸困难,exET-1半衰期仅7min[6],0.5h后失活,此时85%大鼠症状缓解,提示缺氧症状主要是exET-1与小气道接触,致支气管痉挛而发生急性缺氧引起。但气管滴药3h后,仍有80%大鼠发生不同程度PH,且肺组织irET-1阳性表达强度及阳性表达率隨PH程度的加重而升高,说明所检测到的irET-1为enET-1而非exET-1,PH由内源性而非外源性ET-1所致。推测exET-1气管内滴入致急性缺氧,导致作为氧感受器的肺神经内分泌细胞通过吐胞作用,分泌出呈调节性的、有一定分泌限量的缩血管因子enET-1及扩血管活性肽降钙素基因相关肽,它们相互代偿与调节,以维持肺血管舒缩功能的稳定[7],使存活鼠急性缺氧症状得以缓解。若急性缺氧持续,肺神经内分泌细胞膜上的还原型辅酶Ⅱ氧化酶被激活[8],再通过激活PVEC中缺氧诱导因子-1,导致enET-1呈持续性异常分泌[7]及本实验中肺组织irET-1有异常阳性表达

2. enET-1与OFR的关系 急性缺氧1h,PVEC中enET-1基因转录加快,前内皮素原互补DNA(ppETcDNA)的转录速率可增加4~8倍[9],导致enET-1异常分泌增加,后者经自分泌途径大量生成OFR[10],OFR又通过损伤PVCE中线粒体DNA及致细胞膜脂质过氧化损害而致肺出血[2]。本实验发现OFR的最终产物MDA含量,隨PH程度的加重而增加,进一步证实OFR参与了肺出血的形成过程。由于PVEC损害程度与MDA产生呈平行关系,本动物实验条件相同而肺出血程度不一,相信与不同个体对缺氧的耐受性、OFR的生成量及抗氧化酶活性等各不相同有关。

3. enET-1与NO的关系 由PVEC中eNOS生成和分泌的NO,是一种胞间通讯的气体分子。生理情况下,enET-1经由自分泌途径与PVEC膜上ETB受体结合后,通过钙调蛋白激活eNOS,再通过L-精氨酸-瓜氨酸途径生成NO[11]。NO从PVEC分泌后,可激活肺血管平滑肌细胞中鳥苷酸环化酶受体介导的信号转导,导致肺血管扩张[10];並可引起平滑肌细胞膜超极化,抵抗enET-1的缩血管作用[12];NO在PVEC内又可反饋抑制enET-1的释放;故此enET-1与NO的适量分泌,对维持肺血管正常结构和功能有重要意义。急性缺氧早期,PVEC内enET-1分泌增加, eNOS活性增强,约30min内NO代偿性增加以与enET-1拮抗,若缺氧持续,OFR可导致PVEC受损而使eNOS活性表达受抑制,NO生成减少[14]。本实验于滴药3h后, ireNOS阳性表达强度及阳性表达率不但未见升高,反而隨PH程度的加重而下降,提示检测时己过了急性缺氧早期而处于缺氧持续状态,此时属基础性、调节性分泌而发挥生理效应的NO ,己不能持续制约enET-1的缩血管作用及对PVEC的损害作用[15],以致发生肺出血。此结果亦提示,外源性NO吸入,作为eNOS活性降低后内源性NO耗竭的补充,有可能成为拮抗enET-1致肺出血的新疗法之一。

参考

1 陈克正, 高晓燕.. 内皮素致肺出血及降钙素基因相关肽拮抗内皮素作用研究. 中华儿科

杂志, 2004,42:

2. 陈克正, 王卫, 吕回. 肺出血大鼠肺组织病理与肺内氧自由基的改变 小儿急救医学

,2002,9:8-10.

3 陈克正, 王卫. 新生大鼠肺出血动物模型的建立及对临床的启示. 中国现代儿科杂志,

2002,4:357-360

4 Ackerman VArpi SBelline A. Constitutive expression of endothelin in bronchial epithelial cells of patients with symptomatic and asymptomatic asthma and modulation by histamine and interleukin-1. J Allergy Immunol, 1995,96:618-627

5. 王卫, 吕回. 新生鼠出血肺组织中内皮素、降钙素基因相关肽与氧自由基的关系. 广东医学, 2003,24:8-10

6.. 董宗祈 内皮素的研究进展. 中国实用儿科杂志1998,13:237-238

7. 陈克正,陈光华 肺组织中ET-1CGRP的表达及其与新生儿弥漫性肺出血的关系. 华围产医学杂志, 2004,7:92-95

8. Cutz E, Jackson A. Neuroepithelial bodies as airway oxygen sensors. Respir Physiol, 1999,115:201-214

9. .汤健, 唐朝枢, 杨军, 等主编. 内皮素. 第1版. 北京: 北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社, 1994, 111-112, 137-146

10. 王晓慧, 卢建. 细胞应激 .:金惠銘, 卢建, 殷莲华, 等主编. .细胞分子病理生理学.

1.郑州:郑州大学出版社, 2002,127-138.

11. 卢建. 部分膜受体介导的信号转导. 见:卢建,余应年,许仁宝,主编. 受体信号转导

系统与疾病.第1版. 济南: 山东科学技术出版社,2001,131-163.

12 Giaid A , Nitric oxide and endothelin-1 in pulmonary and hypertension. Chest, 1998,114:s208-212 .

13 Whittle BR. Nitric oxide in physiology and pathology Histochemical J, 1995,27:727-737

14. 王燕,张灵恩,沈惟堂,等. 大鼠肺内一氧化氮的分布及急性缺氧对其活性的影响. 中华

儿科杂志,1998,36:1166-1171

15. Trug WE, Norberg M, Thibeault DW. Effect of inhated nitric oxide in

endothelin-1-induced pulmonary hypertension. Biol Neonate 1998,73:246-253

文章来源:中华急诊医学杂志